目的便秘是多种疾病的病理过程引起的一种复杂的症状。目前临床上通常将便秘分为3类：①慢传输型便秘；②出口梗阻型便秘；③混合型便秘。而慢传输型便秘占慢性便秘的45.5%,是临床上比较常见的一种类型。理论上消化道任何部位对其内容物传输减慢都可能导致便秘,但实际95%的传输减慢发生在结肠,所以慢传输型便秘又称为结肠慢输型便秘,于1986年首次提出,是一类以结肠动力减弱、结肠传输时间延长为主要特点的顽固性便秘,好发于儿童和老人,可引起恶心、呕吐、食欲下降、腹痛、腹胀,甚至肠穿孔,以及心脑血管方面的疾病。随着现代生活节奏加快,生活水平提高,饮食结构改变及社会人口的老龄化,慢传输型便秘发病率逐年上升,已经成为影响现代人们生活质量的常见疾病之一。慢传输型便秘是一类最常见的顽固性便秘,人们很早就对其病因展开研究,但因为慢传输型便秘的发生受多种因素影响,其病因非常复杂,所以迄今为止尚未完全明确。我们从蛋白分子水平寻找慢传输型便秘的发病机制,以达到对其早期治疗提供必要的前期基础。蛋白质组学是一个新兴的研究领域,其核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析,通过对某物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质包括表达水平、结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用等的研究,对蛋白质所执行的生理性、病理性生命活动做出最精细、最准确、最本质的阐述。蛋白质本身的存在形式、活动规律仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。因此,直接研究蛋白质的变化具有不可替代的意义。而且,随着蛋白质组学的研究进展,表达蛋白质组学是现今应用最为广泛的蛋白质组学研究模式。该策略的技术路线是双向电泳建立蛋白质图谱用专业图像扫描分析软件进行图像分析通过质谱及蛋白质数据信息处理技术进行蛋白质的鉴定与分析。我们采用双向电泳技术对结肠慢传输型便秘与正常结肠组织的蛋白质进行分离,通过软件分析和质谱-生物信息学方法寻找疾病相关蛋白质,在蛋白质水平探讨结肠慢传输型便秘发生机制,并对差异蛋白FHL1进行western-blot检测,为结肠慢传输型便秘早期诊断和治疗提供基础资料。方法一、临床资料及标本的采集实验所用的标本均来自中国医科大学附属盛京医院,行全结肠手术切除慢传输型便秘8例,术前诊断符合罗马Ⅲ标准,年龄42-62岁,中位年龄53岁,对照组标本8例,(由于结肠造瘘和结肠息肉等在我院行结肠手术的患者8例正常结肠组织,均无便秘病史)年龄37-65岁,中位年龄52岁。标本离体后立即投入液氮中,24小时后移入-80℃深度冰箱备用。二、结肠慢传输型便秘与对照组结肠组织蛋白质组差异分析1、提取结肠全层组织的总蛋白质,Bradford法进行蛋白定量。2、等电聚焦使用Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪。聚焦后的胶条经两步平衡后进行SDS-PAGE电泳,考染、扫描后用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行图像分析,寻找差异蛋白点。3、切取差异点并进行质谱和生物信息学分析。三、FHL1在慢传输型便秘结肠和对照组结肠中表达情况分析1、提取结肠全层组织的总蛋白质,Bradford法进行蛋白定量。2、用western-blot方法验证该蛋白在结肠中的表达情况,进一步分析FHL1与结肠慢传输型便的相关性。结果一、结肠慢传输型便秘与对照组结肠组织双向电泳图谱差异分析结果使用pH3～10,24cm胶条获得了重复性较好的双向凝胶电泳考染图谱,结肠慢传输型便秘和正常对照组的蛋白识别数分别为1080±51和1280±30个,各凝胶中斑点平均匹配率分别为70%±5%,统计分析使用t-test法,选取蛋白斑点表达差异大于2倍(ratio>2), t-test p<0.05的斑点作为研究蛋白。结肠慢传输型便秘组与对照组间差异蛋白点20个,其中11个为表达上调的蛋白质,9个为表达下调的蛋白质。二、结肠慢传输型便秘组与对照组蛋白质组鉴定结果切取界限清楚、重复性好有明显差异的20个蛋白点,装入含有双蒸水的EP管内,送至北京中关村生命科学园进行二级质谱分析。鉴定出14种蛋白,其他为相应的重复蛋白。三、FHL1蛋白在结肠慢传输型便秘组与对照组组织中的表达Western blot分析发现FHL1蛋白在结肠慢传输型便秘结肠组织中的表达明显下调,与双向电泳分析结果一致,进一步证明了FHL1蛋白与结肠慢传输型便秘的相关性。结论1、应用双向电泳技术获得了重复性较好的慢传输型便秘组与正常结肠组织蛋白质双向电泳图谱。并分析其间差异,发现FHL1等14种蛋白质表达改变。2、进一步验证表明FHL1在慢传输型便秘结肠组织中的表达是下调的。