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T系急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一种以胸腺T细胞发育障碍为特点的具有侵略性的肿瘤疾病,约占儿科急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)病例的10%-15%和成人病例的25%。尽管采用了新的联合化疗方案,但只有70-80%的儿童和40%的成年患者能达到长期缓解,因此T-ALL预后仍然极差。Hedgehog (Hh)信号通路在胚胎发育和成年组织稳态中起关键作用。经典Hh信号通路是Hh配体,其中包括SHH (Sonic hedgehog), DHH (Desert hedgehog)和IHH (Indian hedgehog),与跨膜蛋白受体PTCH (Patched)相结合,进而激活第二个跨膜蛋白SMO (Smoothened),活化的SMO导致GLI蛋白稳定和核内积累。GLI家族包括GLI1 (GLI family zinc finger 1), GLI2 (GLI family zinc finger 2)和GLI3 (GLI family zinc finger 3)。有充分的证据表明,异常活化的Hh信号与多种肿瘤的发生相关联。与SMO拮抗剂环巴胺相比,GLI抑制剂GANT58和GANT61可以更有效的诱导一些癌细胞的生长停滞和凋亡,如髓细胞性白血病细胞,结肠癌细胞,横纹肌肉瘤细胞,ovine鳞状肿瘤细胞和慢性白血病细胞等。但Hh信号通路及GLI抑制剂在T-ALL中的作用尚未有研究报道。此外,最近的调查结果显示磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB/AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶基因(Mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路持续活化是T-ALL的共同特征。人第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homolog, PTEN)的基因水平或翻译后的失活在T-ALL中普遍存在,PTEN失活导致PI3K/AKT/mTOR通路持续活化。该信号通路在调节肿瘤细胞生长,生存和自噬等方面发挥核心作用。哌立福新(Perifosine)是一种新的烷基磷脂类似物,能够阻止AKT膜定位和磷酸化,从而抑制AKT活性。该药物在许多临床前模型显示出抗肿瘤活性,而且目前已进入多种癌症的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床试验,如慢性淋巴细胞白血病,肾细胞癌,卵巢癌,多发性骨髓瘤和结肠直肠癌等。然而,哌立福新的抗肿瘤分子机制尚未完全阐明。在本研究中,我们利用GLI和AKT抑制剂探讨Hh和AKT信号通路在T-ALL细胞中的作用,两条通路的交互作用,及不同药物联合应用的潜在细胞毒性和作用机理。第一部分GANT58抑制Hh信号诱导T-ALL细胞凋亡,并与AKT抑制剂有协同作用Hh和AKT信号通路在调节细胞增殖和存活方面起至关重要的作用,而这些通路的失调可导致肿瘤发生。我们使用了四种不同的T-ALL细胞系：CCRF-CEM细胞系,Jurkat细胞系,人类CEM克隆细胞系C7-14和C1-15,并选择不同的信号抑制剂来研究两条通路在T-ALL的表达情况及功能。1.Hh通路关键信号因子在不同T-ALL细胞系中普遍表达。使用荧光实时定量PCR (real-time RT-PCR)检测到Hh受体PTCH1和SMO, GLI及GLI抑制蛋白SUFU (Suppressor of Fused)在4种细胞系中均有表达。使用蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)检测出在T-ALL细胞系中GLI1蛋白存在两个变异体(GLI1△N和GLI1FL)。GLI1△N在所有T-ALL细胞系中均有表达,但CCRF-CEM, CEM7-14和CEM1-15细胞系表达很低。GLI1FL在CCRF-CEM, CEM7-14和CEM1-15细胞表达很强,但在Jurkat细胞中没有检测到。2.SMO拮抗剂环巴胺对T-ALL细胞只有微弱的细胞毒性,GANT58则表现出较强细胞毒作用。T-ALL细胞对低浓度(1pM或3pM)环巴胺不敏感。而GANT58减少了Hh通路靶基因PTCH1及GLI1的表达,并有效的降低了T-ALL细胞的活力,增加了细胞凋亡和诱导了细胞周期停滞。这些细胞系对GANT58敏感性的顺序是CEM1-15> CEM7-14> CCRF-CEM>Jurkat,这一顺序与GLI1在细胞系中的表达水平一致。3.哌立福新下调T-ALL细胞Hh/GLI通路活性,同时抑制MEK/ERK信号通路可增强该效果。哌立福新降低p-AKT, p-GSK3β及GLI1表达水平,呈剂量依赖性,并且哌立福新增加了ERK1/2磷酸化水平。用MEK/ERK抑制剂PD98059预处理,可以提高哌立福新对GLI1的下调幅度达20%-30%。4.AKT抑制剂与GANT58协同杀伤T-ALL细胞。利用Chou-Talalay方法,我们发现低浓度GANT58与哌立福新或GSK690693联合应用可协同诱导T-ALL细胞死亡。这些结果表明,GANT58并AKT抑制剂与现有的癌症治疗方法联合使用,可能是治疗更多恶性肿瘤的有效方法之一。第二部分哌立福新通过AKT/GSK3β和MEK/ERK途径诱导T-ALL细胞保护性自噬,与氯喹有协同效应自噬是细胞自身蛋白或细胞器在溶酶体中的降解过程,以此实现回收和周转细胞成分,维持细胞的动态平衡。许多研究表明,自噬的失调与人类一些疾病相关,如肿瘤的发生。自噬在肿瘤细胞中的作用很复杂。在癌症的治疗中,它既可以促进细胞的生存,又可以加速细胞死亡。自噬发挥不同,甚至相反的作用,取决于以下情况的不同,如肿瘤的类型,肿瘤的发展阶段及治疗的性质和程度。哌立福新对T-ALL细胞自噬的影响尚未有研究。在本研究中,我们集中探讨在T-ALL中哌立福新是否通过PI3K/AKT或丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路影响自噬,以及自噬在哌立福新诱导细胞死亡中的作用。1.哌立福新降低T-ALL细胞生存率和诱导细胞凋亡。哌立福新抑制CCRF-CEM, CEM7-14, CEM1-15和Jurkat细胞的生长,其24小时50%抑制率(IC50)分别为15.02,13.08,18.06和21.35(pM)。四个细胞系对哌立福新的敏感性顺序：CEM7-14> CCRF-CEM> CEM1-15> Jurkat。在哌立福新处理的4种细胞系中,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinylaspartate specific proteinase 3, caspase 3)被激活,呈剂量依赖性,这表明哌立福新诱导细胞凋亡增加。2.哌立福新诱导T-ALL细胞自噬增强,呈剂量依赖性。在CEM7-14和CEM1-15细胞中,哌立福新诱导LC3-1向LC3-Ⅱ转化；在CCRF-CEM和Jurkat细胞中,哌立福新同时降低LC3-1和LC3-Ⅱ的水平。3.溶酶体抑制剂氯喹(Chloroquine, CQ)抑制自噬作用,增加了T-ALL细胞对哌立福新治疗的敏感性,增强了哌立福新诱导细胞死亡的能力。与单独使用哌立福新相比,CQ与其合用使细胞死亡率增加10%-30%。4.哌立福新在T-ALL细胞中抑制AKT/GSK3P通路和活化MEK/ERK通路；哌立福新通过激活MEK/ERK信号而诱导自噬。哌立福新抑制p-AKT和p-GSK3β的表达,诱导ERKI/2磷酸化的增加,呈剂量依赖性,同时伴随着Caspase3和LC3的改变。MEK/ERK抑制剂PD98059预处理T-ALL细胞阻断了哌立福新增强自噬的作用,强化了哌立福新导致细胞凋亡的作用。