树突状细胞(dendritic cell, DCs)是一种专职抗原递呈细胞(APCs),能够启动初始T细胞活化、增殖、分化并产生免疫效应,在免疫系统中居于独特的地位。成熟DCs能够激发免疫应答,而不成熟DCs则涉及免疫耐受的诱导。因此,研究调节DCs发育成熟的因素及其机制,对于阐明自身免疫病、移植排斥反应、抗肿瘤免疫等的机制和探索防治措施有着重要的意义。神经内分泌系统和免疫系统之间存在双向调节作用。神经内分泌系统主要通过激素及神经通路来调节免疫系统的功能,而免疫系统则通过细胞因子等免疫分子对神经内分泌系统的功能进行调节。这种相互作用形成复杂的整体调节网络,对于抵御疾病、维持机体内环境的稳定具有重要的作用。α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)由13个氨基酸组成,是神经-内分泌-免疫调节中的重要分子之一。α-MSH不仅影响黑素生成过程,而且具有多种生物学活性,其明显的抗炎、退热及免疫调节作用越来越引起人们的重视。有文献报道,人外周血单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived dendritic cell ,MoDCs)表达α-MSH的受体MC1R。α-MSH通过MC1R可引起MoDCs表达CD86和CD40下降。本室以往的研究表明,α-MSH有逆转TNF-α诱导的MoDC(sTNF-α-MoDCs)成熟的作用。为探讨α-MSH逆转TNF-α-MoDCs成熟的作用机制,我们采用蛋白质组学技术进行了研究。结果显示,膜联蛋白Ⅰ(Annexin A1, ANXA1)在α-MSH处理的TNF-α-MoDCs中表达明显升高。ANXA1亦被称为lipocortin1,属于ANXA超家族,是具有Ca2+以及磷脂结合活性的37kDa的蛋白。ANXA1最初被认为是糖皮质激素(GC)作用于大鼠腹腔巨噬细胞的诱导蛋白,随后研究发现,ANXA1还是细胞胞内和胞间的信号分子,在细胞的很多生命活动中起重要作用,比如细胞分化、凋亡、膜泡融合、内吞、胞吐以及对神经元的保护等。在α-MSH逆转TNF-α-MoDCs的成熟过程中,ANXA1表达增多,是否意味着ANXA1在MoDCs成熟过程中起到重要作用呢?我们构建了ANXA1的高表达质粒转染TNF-α-MoDCs,检测MoDCs的表型、吞噬能力、细胞因子分泌以及刺激同种异体T细胞增殖的能力,以验证ANXA1表达增多是否能够逆转TNF-α-MoDCs的成熟。另一方面,我们设计了ANXA1-siRNA并转染TNF-α+NDP-MSH-MoDCs。用ANXA1-siRNA干扰TNF-α+NDP-MSH-MoDCs中ANXA1的表达,检测MoDCs的表型、吞噬能力、细胞因子分泌以及刺激同种异体T细胞增殖的能力。我们通过以上实验,试图证明:①ANXA1是否参与α-MSH/NDP-MSH逆转TNF-α-MoDCs成熟的信号通路;②ANXA1高表达是否能够逆转TNF-α-MoDCs的成熟。在本课题第一部分,我们从U937细胞中通过RT-PCR法得到ANXA1片段,通过转化、抽提、纯化、双酶切和连接等分子克隆技术,构建了ANXA1高表达质粒pShuttle-CMV-ANXA1。将此质粒转染293a细胞,可高表达ANXA1蛋白,说明质粒构建成功。将空质粒pShuttle-CMV转染TNF-α-MoDCs,形成空质粒对照组:TNF-α+pShuttle-CMV-MoDCs;将pShuttle-CMV-ANXA1转染TNF-α-MoDCs,形成ANXA1高表达组:TNF-α+pShuttle-CMV-ANXA1-MoDCs,与前者相比,其表达ANXA1增多。由于转染试剂的毒性作用,与TNF-α-MoDCs相比,空质粒对照组也显示出进一步的成熟。与空质粒对照组相比, ANXA1高表达,可以引起MoDCs表面标志CD86表达减少,以及CD1a表达增多(在本实验体系中,MoDCs的成熟伴随着CD1a的减少,与Xiaochun Cao报道的结果一致);但是,HLA-DR表达增多,MoDCs吞噬能力进一步降低,细胞因子IL-10分泌减少,IL-12p40分泌增多,刺激同种异体T细胞增殖的能力加强。由于ANXA1一般被认为是一种炎症抑制因子,上述结果与我们预期ANXA1的高表达可以一定程度地抑制MoDCs的成熟并不一致。但我们的结果与Tomoko Smyth等的研究发现有类似之处,虽然注射外源ANXA1的N端短肽可以使LPS刺激的巨噬细胞表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)减少,但是内源性ANXA1的高表达可以使LPS刺激的巨噬细胞表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)增多。我们推测,ANXA1高表达并不能完全模拟α-MSH/NDP-MSH所引发的逆转TNF-α-MoDCs成熟的信号通路,所以并没有产生类似于α-MSH/NDP-MSH对TNF-α-MoDCs的成熟逆转作用。再者,或许有另一种可能,即适量的ANXA1表达对于维持MoDCs的不成熟状态非常重要,过量表达反而会促进TNF-α-MoDCs的成熟。在本课题第二部分,我们设计并合成了ANXA1-siRNA。将non-siRNA转染TNF-α+NDP-MSH-MoDCs ,形成非干扰对照组: TNF-α+NDP-MSH +non-siRNA-MoDCs;将ANXA1-siRNA转染TNF-α+NDP-MSH-MoDCs,形成ANXA1干扰组:TNF-α+NDP-MSH+ANXA1-siRNA-MoDCs,与前者相比,此组ANXA1表达减少。与TNF-α+NDP-MSH+non-siRNA-MoDCs相比,TNF-α+NDP-MSH +ANXA1-si R N A-MoDCs表面标志HLA-DR表达增多,CD1a表达减少,吞噬能力下降,细胞因子IL-10的分泌下降,IL-12p40分泌增多,刺激同种异体T细胞增殖的能力增强。这说明,干预MoDCs中的ANXA1表达可以促进MoDCs成熟;ANXA1参与α-MSH/NDP-MSH逆转TNF-α-MoDCs成熟的信号转导过程。综合两部分结果提示,ANXA1在MoDCs成熟过程中起一定的作用;ANXA1参与α-MSH/NDP-MSH逆转TNF-α-MoDCs成熟的信号转导过程。本实验为阐明α-MSH的抗炎和免疫调节机制,以及探明DC发育成熟和功能的调节机制提供了新的实验依据。