目的:　　 脑外伤的病理生理机制复杂，炎症反应是脑外伤后继发性脑损伤的重要组成部分。脑外伤后，炎症反应加剧，IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子生成增加，导致神经细胞凋亡，从而进一步加重外伤性脑损伤，影响预后。因此，抑制炎症因子生成可对脑外伤起到一定程度的保护作用。　　 环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢、前列腺素(prostaglandin，PG)和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)生物合成过程中重要的限速酶，是诱导性酶，在正常生理状态下几乎不表达或甚少表达，主要表达于炎症细胞，特别是巨噬细胞、单核细胞和滑膜细胞，是对组织缺氧和损伤的反应。近期许多研究表明，脑外伤早期伴随炎症反应的发生，脑组织中COX-2的表达常异常增高，且这种增高状态持续越久，预后越不良，COX-2的大量生成可能是导致患者损伤加剧的重要因素之一，通过抑制COX-2的产生可以为治疗脑创伤早期炎症反应提供新途径，因此，COX-2在脑外伤的病理机制的研究已经成为近阶段的研究热点。　　 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是体内的一个重要炎性因子，由单核-巨噬细胞分泌，能促进中性粒细胞吞噬，杀伤和抑制肿瘤细胞，促进细胞增殖和分化，激发细胞因子网络，继而造成细胞因子的级联反应，进而诱生其他的炎性介质从不同的环节参与炎性反应，引起器官组织损伤，是炎症反应的一个重要启动因子。脑外伤后，TNF-α生成增加，导致神经细胞凋亡，从而进一步加重外伤性脑损伤。但是TNF-α是否参与了COX-2调节的脑外伤病理机制，是一个值得探讨的问题。　　 白细胞介素-1β（IL-1β）是一种具有多种生物学功能的炎性细胞因子，可引起白细胞的聚集并可刺激白细胞、内皮细胞等表达细胞间粘附分子，介导中性粒细胞的浸润，进而加重损伤区的炎症反应;可诱导TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的释放，增加NO的合成和释放。脑外伤后，IL-1β生成增加，导致神经细胞凋亡，从而进一步加重外伤性脑损伤。这都提示着IL-1β在脑外伤发病中有着重要作用，但是IL-1β是否参与了COX-2调节的脑外伤病理机制尚不十分清楚。　　 本研究通过自由落体法复制闭合性脑外伤小鼠模型，利用免疫组织化学方法和Western blot方法检测脑外伤组、吲哚美辛治疗组和正常组小鼠海马TNF-α和IL-1β的表达量的变化，探讨吲哚美辛能否通过调节炎性因子TNF-α和IL-1β参与脑外伤的病理机制的调节。通过这些问题的解决，我们将进一步清楚COX-2参与脑外伤的病理机制，为寻找新的脑外伤治疗方法提供理论依据。　　 材料和方法:　　 一、实验材料　　 1、实验动物本研究采用雄性BALB/c小鼠90只，由中国医科大学实验动物中心提供，体重在18-25g。　　 2、主要试剂兔抗小鼠IL-1β抗体，兔抗小鼠TNF-α抗体均购于Sigma公司;辣根过氧化物酶结合羊抗兔免疫球蛋白和SP法免疫组化试剂盒均购于武汉博士德试剂公司;β-actin，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二次抗体均购于北京中杉公司。　　 3、主要仪器电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机;Motic Images Advanced3.2图象分析系统;　　 二、实验方法　　 1、制备小鼠脑外伤模型.采用改良的自由落体法复制闭合性脑外伤小鼠模型。　　 2、免疫组织化学检测各组小鼠海马TNF-α和IL-1β的表达。　　 3、Western blot方法检测各组小鼠海马TNF-α和IL-1β的表达。　　 4、图象分析　　 Western blot结果用Chemi Imager5500V2.03软件扫描，用Fluor Chen2.0软件定量分析显色带的MOD值。免疫组化结果用Motic Images Advanced3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。　　 5、统计学处理　　 所有数值均以均数±标准差表示，实验数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，组间比较进行t检验。　　 实验结果:　　 一、TNF-α　　 免疫组化方法检测小鼠海马TNF-α蛋白表达时发现，假手术组小鼠海马TNF-α蛋白仅有少量的表达，脑损伤6h小鼠海马TNF-α蛋白表达显著升高，12h表达量最高，3d时略有下降，7d时仍显著高于假手术组，P＜0.05;而与相同时间点脑外伤组相比，吲哚美辛治疗组的小鼠海马TNF-α蛋白表达的光密度值显著降低，P＜0.05。　　 Western blot结果分析各组小鼠海马TNF-α蛋白的表达时发现，与假手术组小鼠海马TNF-α蛋白表达与内参照β-actin的光密度比值相比较，6h时间点脑外伤组小鼠海马TNF-α蛋白表达与β-actin的光密度比值显著升高，12h表达量最高，3d时略有下降，7d时仍显著高于假手术组，P＜0.05;而与相同时间点脑外伤组相比，吲哚美辛治疗组的小鼠海马TNF-α蛋白表达的光密度值显著降低，P＜0.05。　　 二、IL-1β　　 免疫组化方法检测小鼠海马IL-1β蛋白表达时发现，假手术组小鼠海马IL-1β蛋白仅有少量的表达，脑损伤6h小鼠海马IL-1β蛋白表达显著升高，3d时表达量最高，7d时仍显著高于假手术组，P＜0.05;而与相同时间点脑外伤组相比，吲哚美辛治疗组的小鼠海马IL-1β蛋白表达的光密度值显著降低，P＜0.05。　　 Western blot结果分析各组小鼠海马IL-1β蛋白的表达时发现，与假手术组小鼠海马IL-1β蛋白表达与内参照β-actin的光密度比值相比较，6h时间点脑外伤组小鼠海马IL-1β蛋白表达与β-actin的光密度比值显著升高，3d时表达量最高，7d时仍显著高于假手术组，P＜0.05;而与相同时间点脑外伤组相比，吲哚美辛治疗组的小鼠海马IL-1β蛋白表达的光密度值显著降低，P＜0.05。　　 讨论:　　 在本实验的研究中发现，假手术组小鼠海马炎性因子TNF-α蛋白仅有少量的表达，而在脑损伤后表达迅速增加，脑损伤后6h时，脑损伤组小鼠海马TNF-α蛋白表达已显著升高，12h时，TNF-α蛋白达到峰值，3d时略有下降，到7d时仍显著高于假手术组，P＜0.05;而在经腹腔注射吲哚美辛后的6h，脑损伤小鼠海马的TNF-α蛋白的表达开始降低，与脑损伤组相比差异显著，P＜0.05，结果提示降低TNF-α蛋白的表达，很可能是吲哚美辛降低脑外伤早期炎症反应的机制之一。而与相同时间点的24h、3d和7d脑外伤组相比较，吲哚美辛治疗组的小鼠海马TNF-α蛋白表达的光密度值依然显著降低，结果提示，吲哚美辛对于脑外伤后7d时的炎症反应依然发挥着作用。　　 本实验研究还发现，假手术组小鼠海马炎性因子IL-1β蛋白仅有少量的表达，而在脑损伤后表达迅速增加，脑损伤后6h时，脑损伤组小鼠海马IL-1β蛋白表达已显著升高，3d时， IL-1β蛋白达到峰值，到7d时仍显著高于假手术组，P＜0.05;而在经腹腔注射吲哚美辛后的6h，脑损伤小鼠海马的IL-1β蛋白的表达开始降低，与脑损伤组相比差异显著，P＜0.05，结果提示降低IL-1β蛋白的表达，很可能是吲哚美辛降低脑外伤早期炎症反应的机制之一。而与其他相同时间点的脑外伤组相比较，吲哚美辛治疗组的小鼠海马IL-1β蛋白表达的光密度值依然显著降低，结果提示，吲哚美辛对于脑外伤后7d时的炎症反应依然发挥着作用。　　 本研究进一步明确了COX-2参与脑外伤的病理机制，为寻找新的治疗脑外伤方法提供理论依据。　　 结论:　　 1、吲哚美辛能下调脑外伤小鼠海马TNF-α蛋白的表达，提示吲哚美辛很可能是通过降低炎性因子TNF-α来调节脑外伤早期炎症反应。　　 2、吲哚美辛能下调脑外伤小鼠海马IL-1β蛋白的表达，提示吲哚美辛很可能是通过降低炎性因子IL-1来调节脑外伤早期炎症反应。