细菌双杂交筛选肽适体抑制稻瘟菌孢子

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稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)是典型的植物致病菌,其侵染过程依赖多种信号通路参与调控,包括环化腺苷酸(cAMP)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路和Ca2+信号通路。最新研究发现,除了cAMP信号通路和MAPK信号通路,Ca2+信号通路在稻瘟菌的生长发育、孢子萌发、侵染结构形成和致病性方面也具有重要作用。  钙调蛋白(calmodulin,CaM),是Ca2+信号通路中的重要组成部分,在稻瘟菌各个发育阶段分布广泛,并且与稻瘟菌孢子萌发和附着胞形成密切相关,是研究稻瘟菌Ca2+信号通路的关键性切入点。  钙调蛋白拮抗剂是以钙调蛋白为靶点的药物,对研究钙调蛋白在稻瘟菌致病性方面的功能具有重要意义。但是,目前市场上钙调蛋白拮抗剂均具有专一性不强的特点,且无任何稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的研究报道,使得钙调蛋白拮抗剂不仅单一作用于稻瘟菌钙调蛋白,还会影响其他的通路蛋白,无法实现单一变量的实验策略。  本研究采用细菌双杂交系统,以稻瘟菌钙调蛋白CaM为“诱饵”,从肽适体文库中筛选得到既能与CaM特异性相互作用,又具有抑制稻瘟菌孢子发育功能的肽适体(peptide aptamer,pep-aptamer),并对肽适体与CaM之间相互作用的分子机理进行了的初步探究,所获结果如下:  克隆稻瘟菌钙调蛋白CaM,构建“诱饵”表达载体pBT-CaM,利用细菌双杂交系统,从肽适体文库中筛选获得了34条能够与CaM特异性相互作用的肽适体。  诱导表达34条肽适体蛋白并分别与稻瘟菌孢子悬液孵育,筛选出7种具有抑制稻瘟菌孢子发育的肽适体。通过核苷酸序列分析和氨基酸序列分析,最终确定肽适体D4为筛选得到的序列正确、且具有特异性抑制孢子能力的肽适体。  分别构建表达肽适体D4及CaM的载体pET-SNP-D4和pET-28a-CaM,经转化、诱导表达、镍柱亲和层析和透析后,抑菌实验证实肽适体SNP-D4对稻瘟菌孢子的萌发、芽管的生长以及附着胞的形成均具有良好的抑制效果。  通过酶连免疫吸附技术(ELISA)推算出CaM与SNP-D4之间的亲和作用常数Kd值达到20μM。构建稻瘟菌CaM蛋白ΔC73和ΔN76截短体,细菌双杂交证明肽适体SNP-D4作用于CaM蛋白的N端。  综上所述,本研究首次采用细菌双杂交系统,以稻瘟菌CaM蛋白为靶标筛选出了既能与CaM特异性相互作用、又具有抑制稻瘟菌孢子发育功能的肽适体SNP-D4,并对SNP-D4与CaM之间的相互作用机理进行了初步探究。所筛选得到的肽适体不仅对稻瘟菌Ca2+信号通路的研究具有重要意义,而且具有作为生物农药的潜能。
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