碳纳米管(CNTs)是碳的一种同素异形体,是具有独特纳米结构、理化和生物学性能的纳米材料。CNTs与机体的相互作用及其在生物医学领域中的应用是当前研究的一个热点。当前研究表明神经组织,特别是中枢神经系统(CNS)对于CNTs具有良好的相容性,并且CNTs所展现出的一些特殊性能使其在CNS疾病的诊断与治疗中具有重要的应用前景。神经胶质瘤(glioma)是起源于神经胶质细胞的肿瘤,是中枢神经系统最常见的、恶性度最高并且难于治疗的肿瘤性疾病。化疗是肿瘤治疗的重要手段,但多药耐药现象(MDR)是导致神经胶质瘤化疗失败的主要原因,而肿瘤细胞表面高表达一些具有外排功能的转运蛋白,如P-糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP)是MDR的主要机制。本课题对多壁碳纳米管(MWCNTs)与人MDR胶质瘤细胞的相互作用开展了体外研究。本课题首先建立、优化了一系列基于荧光探针染色结合流式细胞检测技术(FCM)的手段,以适用于MWCNTs的细胞效应研究。随后证明了MWCNTs对Pgp和MRP介导的药物转运的影响并对其作用机制进行了初步探讨。本课题包括以下三部分内容。第一部分多壁碳纳米管对人MDR胶质瘤细胞活力的影响[目的]建立荧光探针染色-流式细胞检测术的方法用于分析MWCNTs对人MDR胶质瘤细胞活力的影响。[方法]将人MDR胶质瘤细胞给予不同浓度的MWCNTs处理24h。随后以一系列反映细胞功能不同方面的荧光探针(JC-1、R123、FDA和PI)在in situ(原位)和ex situ(非原位)两种条件下对细胞进行染色,以FCM对各个探针的细胞染色情况进行检测。利用荧光显微镜观察细胞形态以及荧光染色,并利用透射电子显微镜观察细胞对MWCNTs的内化。在研究MWCNTs的细胞效应之前,首先对各探针细胞染色的指征予以表征。[结果]表征实验表明线粒体膜电位是决定R123和JC-1细胞染色的主要因素；而FDA染色则取决于细胞内非特异性酯酶的活性和细胞膜的完整性。但细胞内尚有其他因素可影响R123和FDA的细胞染色。在经过MWCNTs处理的细胞中,R123染色在in situ条件下呈浓度依赖性增强,但在ex situ条件下无明显改变。JC-1染色在in situ条件下呈显著浓度依赖性降低,但在ex situ条件下仅略微减弱。FDA染色在in situ条件下随MWCNTs浓度增加呈“钟形”改变,而在ex situ条件呈小幅度增强。PI染色阳性的细胞数在两种条件下均略微增加。[结论]荧光探针染色结合FCM在经过验证优化以后可有效地用于研究MWCNTs的细胞效应。在本实验的MWCNTs处理浓度和时间条件下,人MDR胶质瘤细胞的总体活力未受明显影响。但涉及细胞膜的一些功能可能发生改变。第二部分多壁碳纳米管对跨细胞膜物质转运的影响[目的]观察MWCNTs对细胞摄取和外排Pgp和MRP底物的影响。[方法]将人MDR胶质瘤细胞给予不同浓度的MWCNTs处理24h。随后在in situ条件下将细胞分别与Pgp底物R123、DOX和MRP前底物FDA和CFDA孵育30min。随后取部分细胞检测R123、DOX、Flu和CF(山FDA和CFDA水解而来)的含量(摄取),其余细胞则置于新鲜培养基中孵育60min后再检测细胞内上述底物的含量(潴留)。对ex situ条件下细胞内R123和Flu的外排也进行了动力学分析。[结果]经MWCNTs处理的in situ细胞对R123的摄取显著提高,而对DOX的摄取却明显减少,但对其他药物的摄取无显著改变。In situ细胞内R123、DOX、Flu和CF的潴留明显增加,外排量也相应减少。动力学分析表明MWCNTs明显降低ex situ细胞对R123和Flu外排的速率[结论]MWCNTs可影响跨细胞膜物质转运,尤其是Pgp/MRP介导的跨膜转运。第三部分多壁碳纳米管对多药耐药相关蛋白转运功能的影响机制[目的]初步探讨MWCNTs对MRP转运功能的影响机制。[方法]首先利用工具药物验证细胞膜电位和细胞内谷胱甘肽(GSH)水平是调控MRP转运功能的重要因素。随后利用荧光探针DiBAC4(3)和DiOC6(3))染色分析MWCNTs对细胞膜电位的影响。分别利用荧光探针DCF-DA染色和试剂盒检测细胞内自由基(ROS)和GSH水平的改变。[结果]调控细胞膜电位和耗竭细胞内GSH均可显著抑制细胞内Flu的外排。细胞膜电位探针(DiBAC4(3)和DiOC6(3))的染色分析显示MWCNTs可降低细胞膜电位。同时也发现经过MWCNTs处理后胶质瘤细胞内可产生大量活性氧自由基(ROS),同时伴随细胞内GSH的显著减少。[结论]MMWCNTs可能通过降低细胞膜电位和氧化应激所致的GSH耗竭来影响MRP的转运功能。