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虫害和草害严重影响作物产量，使用化学农药防治虫害和草害不但会造成严重的环境污染，破坏表层植被的生态平衡，农产品中还会存在对人体有害的农药残留。绿色高效的植物基因工程技术，为控制虫害提供了新的思路，已成为当前防治虫害的重要途径。本研究结合当前植物抗虫和抗除草剂研究现状，构建了单价和双价抗虫植物表达载体，并利用除草剂基因作为筛选标记，在烟草中进行了Bt基因杀虫功能域定位和单价双价基因杀虫功能验证，获得如下研究结果：
（1）基因片段的获得：根据植物密码子特征和Cry1Ab/c蛋白结构特征，人工设计合成1.8kb、2.5kb、3.5kb的片段，分别命名为cry1Ac-1.8Bt、cry1Ac-2.5Bt、cry1Ac-3.5Bt基因。
（2）中间载体的构建：通过酶切连接分别将cry1Ac-1.8Bt、cry1Ac-2.5Bt、cry1Ac-3.5Bt基因连接到实验室已有的中间载体上，并完成对启动子区和终止子区的酶切位点改造。通过PCR的方法，扩增启动子区和终止子区，分别引入SwaI酶切位点和PmeI酶切位点。胶回收扩增片段，再分别替换原有中间载体的启动子区和终止子区。构建完成的中间载体命名为pGY4AB。将cry1Ac-1.8Bt，cry1Ac-2.5Bt，cry1Ac-3.5Bt，vip3Aa，cry2Ah，cry2Ab4基因分别连接到pGY4AB载体上。
（3）单价植物表达载体的构建：通过酶切连接，将pGY4AB1.8Bt，pGY4AB2.5Bt，pGY4AB3.5Bt表达盒分别和pGBIGR79植物表达载体连接，构建完成GR79-EPSPS作为筛选标记，无卡那霉素筛选标记的单价抗虫抗除草剂植物表达载体。命名为pGBIGR79-1.8Bt、pGBIGR79-2.5Bt、pGBIGR79-3.5Bt。
（4）双价植物表达载体的构建：通过酶切连接，将pGY4ABvip3Aa，pGY4AB2Ah和pGY4AB2Ab4表达盒分别和pGBIGR79-1.8Bt，pGBIGR79-2.5Bt，pGBIGR79-3.5Bt植物表达载体连接，构建完成GR79-EPSPS作为筛选标记，无卡那霉素筛选标记的双价抗虫抗除草剂植物表达载体。命名为pGBIGR79-1.8Bt-vip3Aa、pGBIGR79-2.5Bt-2Ah、pGBIGR79-3.5Bt-2Ab4。
（5）转基因烟草的获得：将单价抗虫抗除草剂植物表达载体质粒pGBIGR79-1.8Bt、pGBIGR79-2.5Bt、pGBIGR79-3.5Bt，通过农杆菌介导叶盘法浸染烟草，分别获得了20株，15株和12株再生植株。经过Bt试纸条、GR79试纸条和PCR鉴定阳性植株为16株，12株和9株。阳性转化率分别为80%，80%和75%。将双价抗虫抗除草剂植物表达载体质粒pGBIGR79-1.8Bt-vip3Aa、pGBIGR79-2.5Bt-2Ah、pGBIGR79-3.5Bt-2Ab4，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，分别获得了17株，10株和14株再生植株。经过Bt试纸条、GR79试纸条和PCR鉴定阳性植株为12株，7株和9株。阳性转化率分别为70.5%，70%和64.2%。
（6）转基因烟草的功能鉴定：转pGBIGR79-1.8Bt、pGBIGR79-2.5Bt、pGBIGR79-3.5Bt单价基因烟草杀虫致死率分别为：88.51%、90.59%、90.63%。转pGBIGR79-1.8Bt-vip3Aa、pGBIGR79-2.5Bt-2Ah、pGBIGR79-3.5Bt-2Ab4双价基因烟草杀虫性致死率为88.68%、91.26%、90.66%。
综上所述，本研究通过对Bt基因杀虫结构和功能研究，完成了Bt基因的杀虫功能结构域定位于基因上游的1.8kb的区域内，利用无抗生素选择标记载体，成功构建了单价和双价抗虫抗除草剂复合基因植物表达载体的构建，并导入烟草中验证了杀虫活性。为培育抗虫抗除草剂作物奠定了基础，具有显著的育种价值。
（1）基因片段的获得：根据植物密码子特征和Cry1Ab/c蛋白结构特征，人工设计合成1.8kb、2.5kb、3.5kb的片段，分别命名为cry1Ac-1.8Bt、cry1Ac-2.5Bt、cry1Ac-3.5Bt基因。
（2）中间载体的构建：通过酶切连接分别将cry1Ac-1.8Bt、cry1Ac-2.5Bt、cry1Ac-3.5Bt基因连接到实验室已有的中间载体上，并完成对启动子区和终止子区的酶切位点改造。通过PCR的方法，扩增启动子区和终止子区，分别引入SwaI酶切位点和PmeI酶切位点。胶回收扩增片段，再分别替换原有中间载体的启动子区和终止子区。构建完成的中间载体命名为pGY4AB。将cry1Ac-1.8Bt，cry1Ac-2.5Bt，cry1Ac-3.5Bt，vip3Aa，cry2Ah，cry2Ab4基因分别连接到pGY4AB载体上。
（3）单价植物表达载体的构建：通过酶切连接，将pGY4AB1.8Bt，pGY4AB2.5Bt，pGY4AB3.5Bt表达盒分别和pGBIGR79植物表达载体连接，构建完成GR79-EPSPS作为筛选标记，无卡那霉素筛选标记的单价抗虫抗除草剂植物表达载体。命名为pGBIGR79-1.8Bt、pGBIGR79-2.5Bt、pGBIGR79-3.5Bt。
（4）双价植物表达载体的构建：通过酶切连接，将pGY4ABvip3Aa，pGY4AB2Ah和pGY4AB2Ab4表达盒分别和pGBIGR79-1.8Bt，pGBIGR79-2.5Bt，pGBIGR79-3.5Bt植物表达载体连接，构建完成GR79-EPSPS作为筛选标记，无卡那霉素筛选标记的双价抗虫抗除草剂植物表达载体。命名为pGBIGR79-1.8Bt-vip3Aa、pGBIGR79-2.5Bt-2Ah、pGBIGR79-3.5Bt-2Ab4。
（5）转基因烟草的获得：将单价抗虫抗除草剂植物表达载体质粒pGBIGR79-1.8Bt、pGBIGR79-2.5Bt、pGBIGR79-3.5Bt，通过农杆菌介导叶盘法浸染烟草，分别获得了20株，15株和12株再生植株。经过Bt试纸条、GR79试纸条和PCR鉴定阳性植株为16株，12株和9株。阳性转化率分别为80%，80%和75%。将双价抗虫抗除草剂植物表达载体质粒pGBIGR79-1.8Bt-vip3Aa、pGBIGR79-2.5Bt-2Ah、pGBIGR79-3.5Bt-2Ab4，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，分别获得了17株，10株和14株再生植株。经过Bt试纸条、GR79试纸条和PCR鉴定阳性植株为12株，7株和9株。阳性转化率分别为70.5%，70%和64.2%。
（6）转基因烟草的功能鉴定：转pGBIGR79-1.8Bt、pGBIGR79-2.5Bt、pGBIGR79-3.5Bt单价基因烟草杀虫致死率分别为：88.51%、90.59%、90.63%。转pGBIGR79-1.8Bt-vip3Aa、pGBIGR79-2.5Bt-2Ah、pGBIGR79-3.5Bt-2Ab4双价基因烟草杀虫性致死率为88.68%、91.26%、90.66%。
综上所述，本研究通过对Bt基因杀虫结构和功能研究，完成了Bt基因的杀虫功能结构域定位于基因上游的1.8kb的区域内，利用无抗生素选择标记载体，成功构建了单价和双价抗虫抗除草剂复合基因植物表达载体的构建，并导入烟草中验证了杀虫活性。为培育抗虫抗除草剂作物奠定了基础，具有显著的育种价值。