目的:骨关节炎（OA）是一种与年龄,性别,肥胖和关节损伤紧密相关的异质性疾病。全世界约有2.4亿人受其影响,65岁以上的人群50%为OA患者。由于国内人口老龄化进程的加快,OA发病率仍在不断升高,给社会造成了巨大的经济和思想负担。OA主要病理特征是软骨下骨重塑,关节炎症,骨赘形成和软骨变性。其中软骨变性进一步分为细胞应激和软骨基质代谢。在公认的OA发病机制中,细胞凋亡和分解代谢是增加的,合成代谢是减少的,而细胞自噬取决于OA的进展。但是,由于其复杂的发病机理调控网络,尤其是软骨变性,迄今为止,尚无用于OA的延缓疾病进程的疗法。因此,鉴定OA的发病机制并探索OA的有效治疗策略至关重要。FBXO21是Skp1-cullin-F-box（SCF）类E3泛素化连接酶的一个组分,主要功能是磷酸化依赖性泛素化降解。通常,FBXO21通过泛素化来降解Pglycoprotein和EID1。戏剧性地是,在抗病毒先天应答过程中,FBXO21激活而不是降解细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1）,进而激活JNK和p38通路。据报道,F-box蛋白家族成员中的FBXO32和FBXO6与OA有关。但是,FBXO21在OA中的生物学作用尚不明确。ERK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可以被OA中的细胞因子激活。ERK与软骨钙化和骨赘形成有关,但对软骨基质代谢影响不大。它主要参与调节细胞的增殖,凋亡和自噬。自噬是一种在真核细胞中广泛存在的细胞自我保护的机制,它就像细胞内的清道夫,通过降解细胞内的“垃圾”,维护着细胞稳态。众所周知,自噬在OA的早期增加,而在OA的晚期减少。在早期的预实验中,我们证明ERK是FBXO21的相互作用蛋白之一,于是我们假设FBXO21可能通过靶向ERK和自噬来发挥作用。JUNB属于包括JUND和c-JUN在内的JUN转录因子家族。JUNB在人OA软骨细胞、人OA软骨和小鼠OA软骨中的表达是升高的。在被IL-1β等细胞因子激活后,JUNB可以与基质金属蛋白酶13（MMP13）的启动子结合,促进MMP13的表达并降低II型胶原（COL2A1）的表达。通过JASPAR数据库,我们在FBXO21（智人）启动子中发现了JUNB的结合位点,因此,我们假设JUNB可能通过靶向FBXO21发挥作用。在这项研究中,我们首先证明了FBXO21在膝OA患者的损伤区域关节软骨,衰老和MIA处理诱导的OA大鼠膝关节软骨,以及IL-1β、TNF-α和LPS处理诱导的OA软骨细胞中的表达是相对升高的,并且和临床病理特征相关。然后,我们研究了FBXO21调节OA软骨变性的潜在机制。随后,我们确定了JUNBFBXO21-ERK轴通过抑制自噬来调节OA的细胞凋亡,合成代谢和分解代谢。综上所述,这些结果表明FBXO21的新功能可能为OA提供新的治疗途径。研究方法:1.收集24例行全膝关节置换术的膝OA患者的软骨组织和相关临床病理特征,根据国际软骨修复协会（ICRS）等级,将软骨分为未损伤和损伤区域关节软骨。用免疫印迹法检测FBXO21等相关分子的表达,同时对软骨进行组织学染色和评分。2.往大鼠膝关节腔注射MIA制备不同周数的OA大鼠模型,并收集不同月数的衰老OA大鼠模型。用X光、磁共振和大体成像进行模型评价,并用免疫印迹法和组织化学检测FBXO21等相关分子的表达。3.往大鼠原代软骨细胞和SW1353细胞系,分别加入IL-1β、TNF-α和LPS处理以模拟三种不同的体外OA模型,并用免疫印迹法和免疫荧光检测FBXO21等相关分子的表达。4.一周3次往膝关节腔注射FBXO21腺病毒,再注射MIA造成OA大鼠模型,研究FBXO21在OA中的体内生物学作用。用X光、磁共振、大体成像和组织学染色评分观察软骨破坏程度,并用免疫印迹和q PCR法检测相关表型分子的表达变化。5.在大鼠原代软骨细胞,先用FBXO21腺病毒感染后,再加入IL-1β处理以模拟体外OA模型,研究FBXO21在OA中的体外生物学作用。用免疫印迹和q PCR法检测相关表型分子的表达,并用透射电镜、自噬双标腺病毒和流式凋亡检测自噬和凋亡的变化。6.往大鼠原代软骨细胞,加入IL-1β处理,免疫沉淀后打质谱,再用免疫共沉淀进行验证,寻找FBXO21的潜在下游互作蛋白。7.在大鼠原代软骨细胞,先用FBXO21敲减腺病毒感染后,再同时加入IL-1β和ERK激活剂Honokiol或自噬抑制剂3-MA处理,研究FBXO21能否通过激活ERK进而抑制自噬或通过抑制自噬继而促进变性。用免疫印迹、自噬双标腺病毒和流式凋亡检测自噬、凋亡、合成代谢和分解代谢的变化。8.往SW1353细胞系,加入IL-1β处理模拟体外OA模型,用染色质免疫共沉淀证明转录因子JUNB能结合到FBXO21的启动子上。9.往大鼠原代软骨细胞和SW1353细胞系,同时加入JUNB的敲减腺病毒或质粒和FBXO21的过表达腺病毒或质粒,最后再加入IL-1β处理,研究JUNB能否通过激活FBXO21的表达继而促进变性。用免疫印迹、自噬双标腺病毒和流式凋亡检测自噬、凋亡、合成代谢和分解代谢的变化。结果:1.FBXO21在膝OA患者损伤区域关节软骨的表达是升高的,并且和临床病理特征相关（1）24例膝OA患者的术前术后X线和术前MRI图像:观察到膝OA患者的关节间隙明显狭窄、软骨面不光滑和骨赘增生明显。（2）软骨组织学染色评分:对软骨进行阿利新蓝、番红O、甲苯胺蓝染色和国际骨关节炎研究协会（OARSI）评分,把关节软骨分为未损伤和损伤区域关节软骨。未损伤软骨表面是平滑完整的,软骨细胞排列规则有序。相反,损伤软骨表面则出现了裂缝和裂痕,表面粗糙且软骨细胞排列紊乱。（3）免疫印迹:与非损伤软骨相比,损伤软骨中的FBXO21和MMP13在蛋白水平显着上调,反之,COL2A1明显下调。（4）24个OA患者的基线资料表:膝OA患者损伤软骨中FBXO21相对低表达有10例,FBXO21相对高表达有14例。（5）FBXO21表达值与24个膝OA患者基线资料的相关性:FBXO21相对高表达与Kellgren-Lawrence等级紧密相关。（6）FBXO21表达值与24个膝OA患者基线资料的Spearman相关性分析:FBXO21相对高表达与体重指数（BMI）、肥胖分级和Kellgren-Lawrence等级密切相关。2.FBXO21在OA大鼠膝关节软骨的表达是升高的,并且与OA的严重程度成正相关（1）OA模型造模评价:在衰老和MIA诱导的大鼠OA模型中,通过大体成像、X线平片、MRI和大体成像评分来确认OA模型造模是否成功。正常膝关节软骨表面平滑完整,关节腔内仅有少量清澈不粘膝关节液,膝关节骨性结构完整,膝软骨面平整,膝关节间隙正常。随着OA的加重,不断加剧的软骨表面粗糙、纤维化、裂缝、侵蚀直至软骨下骨,关节液增多且变得极其粘稠,关节间隙狭窄。与对照组相比,在12月,18月,MIA第2周和第3周这四组具有显着的统计学意义。（2）免疫印迹:FBXO21和MMP13在衰老和MIA诱导的OA模型中表达逐渐升高,反之,COL2A1表达降低。FBXO21在12月,18月,MIA第2周和第3周这四组中具有统计学意义。（3）免疫组化:FBXO21在衰老OA模型中表达逐渐升高,反之,COL2A1表达降低。与1M对照组相比,COL2A1在6M,12M和18M组以及FBXO21在12M和18M组中的表达变化具有统计学意义。3.FBXO21在OA软骨细胞的表达是升高的,并且与OA的严重程度成正相关（1）大鼠原代软骨细胞鉴定:通过阿利新蓝,番红O,甲苯胺蓝和COL2A1免疫组织化学（IHC）染色进行鉴定,证明该细胞确实为大鼠原代软骨细胞。（2）免疫荧光:FBXO21在大鼠原代软骨细胞IL-1β诱导的OA模型中的蛋白表达升高,FBXO21在细胞质和细胞核中都有表达。（3）免疫印迹:FBXO21在IL-1β、TNF-α和LPS处理造成三种不同的OA模型中表达逐渐升高。与对照组相比,用20ng/ml IL-1β、20ng/ml TNF-α、2μg/ml LPS处理的大鼠原代软骨细胞和用10、20ng/ml TNF-α、1μg/ml LPS处理的SW1353细胞中,FBXO21蛋白水平升高具有统计学意义。4.敲减FBXO21能延缓MIA处理大鼠膝关节软骨的OA软骨变性（1）q PCR和免疫印迹:FBXO21表达明显降低,证明FBXO21的敲减是成功的;保护性标记物包括COL2A1、Aggrecan、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和Bcl2/Bax都显着上调。而破坏性标志物包括MMP13则明显下调,除了MMP3蛋白的变化无统计学意义。（2）大体成像、X线平片、MRI和大体成像评分:敲减FBXO21后,膝关节软骨表面粗糙、纤维化、裂缝和侵蚀直至软骨下骨减少,粘稠的关节液减少,关节间隙狭窄有所缓解。并且,与对照组相比,在KD-01和KD-02组中均具有统计学意义。（3）组织学染色评分:甲苯胺蓝、番红O染色、Mankin和OARSI评分显示,敲减FBXO21后,软骨降解减轻、软骨厚度增加、排列紊乱的软骨细胞减少、Mankin和OARSI评分明显降低,具有统计学意义。5.过表达FBXO21能促进MIA处理大鼠膝关节软骨的OA软骨变性（1）q PCR和免疫印迹:FBXO21表达明显升高,证明FBXO21的过表达是成功的;保护性标记物包括COL2A1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和Bcl2/Bax都显着下调,除了体内的COL2A1 m RNA和Aggrecan蛋白。而破坏性标志物包括MMP3和MMP13蛋白水平都明显上调,除了体内的MMP13 m RNA的变化无统计学意义。（2）大体成像、X线平片、MRI和大体成像评分:过表达FBXO21后,膝关节软骨表面粗糙、纤维化、裂缝和侵蚀直至软骨下骨明显增加,粘稠的关节液增多,关节间隙狭窄加剧。并且,与对照组相比,OE-FBXO21组具有统计学意义。（3）组织学染色评分:甲苯胺蓝、番红O染色、Mankin和OARSI评分显示,过表达FBXO21后,软骨降解增加、软骨厚度降低、排列紊乱的软骨细胞增多、Mankin和OARSI评分升高,具有统计学意义。6.敲减FBXO21能延缓IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的OA变性（1）q PCR和免疫印迹:FBXO21表达明显降低,证明FBXO21的敲减是成功的;保护性标记物包括COL2A1、Aggrecan、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和Bcl2/Bax都显着上调,除了体外的Bcl2/Bax蛋白。而破坏性标志物包括MMP3和MMP13都明显下调,具有统计学意义。（2）流式凋亡分析:敲减FBXO21后,IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的凋亡率明显降低。（3）m RFP-GFP-LC3腺病毒双标和透射电镜:敲减FBXO21后,OA软骨细胞的自噬溶酶体（ALs）和具有双膜特征的自噬小体（APs）明显上调,具有统计学意义。7.过表达FBXO21能促进IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的OA变性（1）q PCR和免疫印迹:FBXO21表达明显升高,证明FBXO21的过表达是成功的;保护性标记物包括COL2A1、Aggrecan、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和Bcl2/Bax都明显下调。而破坏性标志物包括MMP3和MMP13都显着上调。（2）流式凋亡分析:过表达FBXO21后,IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的凋亡率明显上调。（3）m RFP-GFP-LC3腺病毒双标和透射电镜:过表达FBXO21后,OA软骨细胞的自噬溶酶体（ALs）和具有双膜特征的自噬小体（APs）明显减少,具有统计学意义。8.在IL-1β处理大鼠原代软骨细胞,FBXO21通过与ERK相互作用并使其磷酸化（1）直接机制:通过蛋白质组学分析（LC-MS/MS）,在纯化的复合物中检测到ERK蛋白的肽序列,表明ERK是FBXO21的潜在结合蛋白。通过双向免疫共沉淀证实了ERK与FBXO21之间的相互作用。（2）免疫印迹:过表达FBXO21显着增加了IL-1β处理大鼠软骨细胞中的磷酸化ERK表达,反之,敲减FBXO21显著减少磷酸化ERK表达,均具有统计学意义。9.FBXO21通过磷酸化激活ERK从而抑制IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的自噬（1）免疫印迹和m RFP-GFP-LC3腺病毒双标:ERK激活剂Honokiol处理SD大鼠的OA软骨细胞（20ng/ml IL-1β处理）后,敲减FBXO21介导的LC3II/I、Beclin1、ALs和APs的上调均被逆转,具有统计学意义。10.FBXO21通过抑制自噬从而增强IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的OA变性（1）免疫印迹和流式凋亡分析:自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理SD大鼠的OA软骨细胞（20ng/ml IL-1β处理）后,敲减FBXO21介导的凋亡水平降低,COL2A1和Aggrecan表达上调被显著逆转,具有统计学意义。11.在IL-1β处理SW1353细胞系,JUNB能够结合在FBXO21的启动子上（1）FBXO21转录因子预测:用JASPAR数据库来预测JUNB是FBXO21（智人）的潜在转录因子。（2）染色质免疫沉淀:在IL-1β处理SW1353细胞系上,JUNB与FBXO21启动子在预测性结合位点1即PCR2（96.43倍）存在直接靶向结合,具有统计学意义。12.JUNB通过激活FBXO21的表达,进而促进OA变性（1）免疫印迹:JUNB不仅在膝OA患者损伤软骨的表达明显上调具有统计学意义,而且与损伤软骨的FBXO21表达呈正相关,具有统计学意义。（2）免疫印迹,m RFP-GFP-LC3腺病毒双标和流式细胞仪实验:在SW1353细胞系,我们观察到过表达FBXO21后,KD-JUNB介导的MMP3降低,自噬水平升高被显着逆转,具有统计学意义。在大鼠原代软骨细胞,我们观察到过表达FBXO21后,KD-JUNB介导的MMP3降低,COL2A1、aggrecan和自噬水平升高被显着逆转,具有统计学意义。结论:1.FBXO21在膝OA患者的损伤区域关节软骨的表达是明显上调的,并且与包括Kellgren-Lawrence等级、BMI和肥胖分级等临床病理特征相关。2.FBXO21在MIA和衰老这两种OA模型的SD大鼠膝关节软骨的表达是升高的,并且与OA的严重程度成正相关,呈处理时间梯度依赖性。3.FBXO21在IL-1β,TNF-α和LPS三种OA模型的软骨细胞的表达是升高的,并且与OA的严重程度成正相关,呈处理浓度梯度依赖性。4.膝关节腔注射FBXO21敲减腺病毒能延缓MIA处理大鼠膝关节软骨的OA软骨变性,包括软骨基质合成代谢升高、分解代谢降低、细胞自噬升高、凋亡减少和软骨破坏降低。5.膝关节腔注射FBXO21过表达腺病毒能促进MIA处理大鼠膝关节软骨的OA软骨变性。6.敲减FBXO21能延缓IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的OA变性,包括软骨基质合成代谢升高、分解代谢降低、细胞自噬明显升高和凋亡减少。7.过表达FBXO21能促进IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的OA变性。8.在IL-1β处理的大鼠原代软骨细胞中,FBXO21与ERK存在空间上的结合,并通过磷酸化使其活化。9.FBXO21通过磷酸化激活ERK从而抑制IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的自噬。10.FBXO21通过抑制自噬从而增强IL-1β处理大鼠原代软骨细胞的OA变性。11.在IL-1β处理SW1353细胞系,JUNB与FBXO21启动子在预测性结合位点1（96.43倍）存在直接靶向结合。12.JUNB不仅在膝OA患者的损伤区域关节软骨的表达是明显上调的,而且与损伤软骨FBXO21的表达呈正相关。13.JUNB通过激活SW1353细胞和大鼠原代软骨细胞中FBXO21的表达来加速与OA相关的变性,包括软骨基质合成代谢降低、分解代谢升高和细胞自噬减少。14.综上所述,JUNB-FBXO21-ERK轴在OA中通过抑制自噬进而促进软骨变性。