论文部分内容阅读
【目的】采用亚阈值经瞳孔温热疗法(transpupillary thermotherapy,TTT)对视神经乳头温热刺激后观察视神经钳夹损伤(optic nerve crush,ONC)后1W、2W、4W视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)神经保护作用以及对Hsp60表达的影响。本研究为临床试验奠定方法和理论基础,以期为青光眼视神经病变及其他神经变性性疾病的防治寻找新的方法。【材料和方法】利用810nm二极管激光(激光参数为直径0.5mm、照射时间60s、能量60mW)对BN色素大鼠视乳头温热刺激后,制作ONC模型,利用经上丘RGCs逆行标记技术对损伤后1W、2W、4W的RGCs进行荧光金标记计数,比较各相应时间点正常对照组、单纯ONC组、假手术组、TTT+ONC组、单纯TTT组的RGCs计数,来观察单次亚阈值TTT对BN色素大鼠ONC模型RGCs的保护作用;为观察槲皮素(quercetin,Q,一种Hsp抑制剂)对单次亚阈值TTT照射BN色素大鼠视乳头部位ONC模型的RGCs保护作用的影响,予TTT干预前6h,BN色素大鼠腹腔内注射Quercetin(4mg/kg)连续腹腔注射达7d,比较各相应时间点TTT+ONC组、TTT+ONC+Q组、单纯腹腔注射Q组、单纯腹腔注射生理盐水组的RGCs计数,来观察quercetin对ONC模型RGCs神经保护的影响作用;应用免疫组织化学染色的方法定性观察单次亚阈值TTT照射BN色素大鼠视乳头部位Hsp60的表达位置和强度,为内源性Hsps表达对RGCs神经保护作用提供依据;为观察单次亚阈值TTT对BN色素大鼠视乳头及周围组织的损伤,对单次亚阈值TTT照射后1W视乳头及周围视网膜进行光镜和电镜观察。【结果】在ONC模型单次亚阈值TTT干预眼1W结果:视网膜平均RGCs的密度在正常对照组为2340.33±132.36 cells/mm~2,单纯ONC组为1336.17±110.30 cells/mm~2,假手术组为2242.17±197.08 cells/mm~2,TTT+ONC组为1669±132.43 cells/mm~2,单纯TTT组为2373.33±174.43 cells/mm~2,TTT+ONC+Q组为1130.67±245.63cells/mm~2,单纯腹腔注射Q组为2295±137.06 cells/mm~2;单纯腹腔注射生理盐水组为2284.8±127.92 cells/mm~2;TTT+ONC组与单纯ONC组平均RGCs的密度比较差异有显著性统计学意义(t=-7.65,p=0.001),TTT+ONC组的平均RGCs的密度明显比单纯ONC组高;TTT+ONC+Q组与TTT+ONC组比较差异有显著性统计学意义(t=3.876,p=0.012),TTT+ONC+Q组平均RGCs的密度明显比TTT+ONC组低;TTT+ONC+Q组与单纯ONC组比较差异无统计学意义(t=1.529,p=0.187)。在ONC模型单次亚阈值TTT干预眼2W结果:视网膜平均RGCs的密度在正常对照组为2307.17±153.42 cells/mm~2,单纯ONC组为984.00±128.02 cells/mm~2;假手术组为2246.67±182.71 cells/mm~2,TTT+ONC组为1299.50±237.63cells/mm~2,单纯TTT组为2295±161.72 cells/mm~2,TTT+ONC+Q组为477.17±162.3cells/mm~2,单纯腹腔注射Q组为2273.40±118.97 cells/mm~2;单纯腹腔注射生理盐水组为2307.80±103.74 cells/mm~2;TTT+ONC组与单纯ONC组平均RGCs的密度比较差异有统计学意义(t=-2.910,p=0.044),TTT+ONC组的平均RGCs的密度明显比单纯ONC组高;而TTT+ONC+Q组与TTT+ONC组比较差异有显著性统计学意义(t=6.126,p=0.002),TTT+ONC+Q组平均RGCs的密度明显比TTT+ONC组低;TTT+ONC+Q组与单纯ONC组比较差异有显著性统计学意义(t=8.553,p=0.000),TTT+ONC+Q组平均RGCs的密度明显比单纯ONC组低。在ONC模型单次亚阈值TTT干预眼4W结果:视网膜平均RGCs的密度在正常对照组BN大鼠为2282.17±121.53cells/mm~2,单纯ONC组为824.00±244.57cells/mm~2,假手术组为2238.5±119.10 cells/mm~2,TTT+ONC组为1091.67±115.03cells/mm~2,单纯TTT组为2259.67±162.16 cells/mm~2,TTT+ONC+Q组为353.83±102.96 cells/mm~2,单纯腹腔注射Q组为2257.40±118.25 cells/mm~2,单纯腹腔注射生理盐水组为2306.80±122.89;TTT+ONC组与单纯ONC组比较平均RGCs的密度差异有显著性统计学意义(t=-2.889,p=0.045),TTT+ONC组的平均RGCs的密度比单纯ONC组高;TTT+ONC+Q组与TTT+ONC组比较差异有显著性统计学意义(t=20.624,p=0.000),TTT+ONC+Q组平均RGCs的密度明显比TTT+ONC组低;TTT+ONC+Q组与单纯ONC组比较差异有显著性统计学意义(t=4.552,p=0.006),TTT+ONC+Q组平均RGCs的密度明显比单纯ONC组低。免疫组织化学染色显示单次亚阈值TTT照射后24h、72h、1W均可见神经纤维层有Hsp60表达增强,其中TTT照射后72h Hsp60表达最强。光镜下观察单次亚阈值TTT照射视乳头后1W时筛板后视神经内小血管轻度扩张,少许横向走形结缔组织;而视乳头旁视网膜各层结构清晰,内外颗粒层细胞核密度均匀,与正常对照组视网膜相比无明显形态学改变。透射电镜下观察单次TTT照射后1W筛板后视神经纤维密度未见明显减少,但神经髓鞘的同心圆形板层结构可见松解、变薄现象发生,部分神经纤维空泡样变性;视乳头旁视网膜RGCs镜下细胞核被膜轻度内陷,但染色质均匀,胞浆细胞器未见明显减少。【结论】采用亚阈值TTT视神经乳头温热刺激后对ONC模型有神经保护作用;TTT神经保护作用与局部诱导热休克蛋白(Heat shock proteins,Hsps)表达有关;单次亚阈值TTT温热刺激对视乳头及周围视网膜存在微小组织损伤,如何提高Hsps神经保护作用降低局部周围组织损伤是我们今后研究的方向。