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研究背景:肝细胞癌（hepatocellar carcinoma,HCC）是原发性肝癌最主要的组织类型,其发病率和死亡率仍稳居前列,严重威胁着人类的健康。虽然免疫治疗在肿瘤治疗中取得了一定的进展,但HCC免疫治疗的总体反应率仍维持在20%左右。目前关于HCC的预后评估主要靠TNM分期和血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）,但由于肿瘤异质性的存在,HCC的预后评价并不准确,尤其是免疫治疗的疗效评估。随着测序或芯片技术等广泛应用,有研究利用生物信息学建立了基于预后标签基因的预测模型,取得了一定的进展,但该部分研究往往限于单个数据集,并针对单一致病因素如HCV感染等,没有额外数据集的验证或忽略了患者临床特征在预后评估中的作用。因此,亟待建立一个基于多平台数据的、综合考虑预后特征基因的表达水平及关键临床特征的HCC预后模型,并进一步解析其肿瘤微环境特征,探究HCC治疗的潜在靶点。在HCC预后模型的数据分析中,我们发现癌旁组织中存在大量浸润的免疫细胞。因此,聚焦于癌旁中浸润的免疫细胞,我们拟通过加权共表达网络分析（weighted correlation network analysis,WGCNA）和CIBERSORT评估的免疫细胞浸润比例进行关联分析,探究HCC癌旁组织中重要免疫细胞（如巨噬细胞）的特征基因,明确癌旁组织在肿瘤研究中的重要作用。肝癌中的免疫微环境主要由免疫抑制细胞构成,其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）占主要部分,多数表现出M2型巨噬细胞特征,即高表达IL10等抗炎因子,起到抑制肿瘤微环境免疫反应的作用。肝脏中巨噬细胞在肝癌的诱发、维持甚至限制肿瘤炎症等方面发挥着核心作用。因此,以巨噬细胞为治疗靶点的抗肿瘤机制的研究也是当前肝癌免疫研究的热点之一。方法与结果:1.建立稳健的HCC预后模型1.1确定HCC的预后关键基因将3个独立数据集的差异基因与2个预后基因集取交集,得到11个预后相关的候选基因。结合弹性网判别（elastic net penalty,ENP）分析和最优子集（best subsets regression,BSR）分析,明确CCNB1和ANXA10系HCC预后的关键基因。1.2建立基于Cox比例风险回归的Nomogram预后模型采用单因素回归分析和生存分析,明确了临床资料TNM分期及BMI＿cut（body mass index,以23.4为界）为临床特征中的关键预后因素。利用多因素Cox比例风险模型建立了Nomogram预后模型。1.3残差法评估Nomogram预后模型假设成立利用Schoenfeld残差法（p＜0.05）、Deviance残差法和Martingale残差法说明Nomogram预后模型假设成立。1.4验证Nomogram预后模型的稳定性利用生存分析和受试操作者曲线（receiver operating characteristic,ROC）比较Nomogram、ENP和BSR等三种预后模型,其中Nomogram预后模型的预测更加准确,曲线下面积（area under curve,AUC）为0.71;利用验证集和C-index算法及校准曲线进一步评估该预后模型的准确性较高。2.基于预后模型分析HCC肿瘤微环境的特征改变2.1 TME中与HCC预后相关的免疫细胞利用生存分析、组间差异分析和单因素回归分析,发现共同淋巴细胞样祖细胞（common lymphoid progenitor,CLP）、辅助T细胞-2（T helper 2 cell,Th2）是HCC预后的高风险因素,而内皮细胞（endothelial cell,EC）和造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）则是HCC预后的低风险因素。2.2缺氧微环境提示HCC预后较差检索HIF1A调节氧稳态的信号通路,并提取通路中相关基因的表达水平进行统计检验,结合Cytoscape进行基因相互作用分析,发现缺氧信号通路与HCC的高风险组密切相关。2.3肿瘤血管生成调控HCC的进展检索VEGF信号通路,并提取相关分子的表达水平进行统计分析,发现VEGF相关分子在HCC高风险组表达上调（p＜0.05）;结合EC的标签基因的表达分析,发现其在HCC高风险组表达更高（p＜0.05）。3.癌旁组织中免疫细胞的浸润与功能解析3.1癌旁中存在大量免疫细胞的浸润通过芯片数据差异分析和GO（Gene Ontology）注释,发现免疫炎症信号多在癌旁中富集;利用ESTIMATE评分,癌旁中的免疫与间质评分更高;统计分析免疫细胞的标记基因CD163、CD3、CD45和CD19,癌旁中免疫标记基因的表达水平更高（p＜0.01）。3.2免疫组化验证癌旁中富集的免疫细胞筛选癌与癌旁组织分界清楚的4例HCC临床组织样本,利用CD45和CD3的抗体,通过免疫组织化学染色,发现阳性区域主要集中于癌旁组织中。3.3构建共表达网络鉴定模块基因集利用聚类分析,剔除样本中变异较大的2例样本;根据近似无标度拓扑算法（R~2=0.85）和平均连通性准则算法,确定合适的软阈值为4,并利用动态剪切树算法构建加权共表达网络,结合模块聚类分析,筛选出特征独立的红色和黑色模块基因集。3.4鉴定与免疫细胞浸润相关的模块基因集利用CIBERSORT运算与WGCNA的模块基因集关联分析,发现红色模块基因集与M2型巨噬细胞的浸润比例有关（R=0.62,p=2e-10）;通过模块基因的连接度与M2型巨噬细胞的基因显著性的相关性分析（cor=0.79,p=3e-21）,再次验证了以上结果。3.5鉴定M2型巨噬细胞的新标记通过相关性检验,发现红色模块的基因与M2型巨噬细胞的最相关（p=0）;利用Cytoscape基因相互作用分析,对模块基因进行排序;提取基因的表达水平与M2型巨噬细胞的浸润比例进行相关性分析,并通过共表达基因的已知功能,推测OIT3可能是M2型巨噬细胞的新型标志物。4.OIT3是介导巨噬细胞M2型极化的关键分子4.1通过小鼠骨髓源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage,BMDM）的芯片数据验证OIT3系巨噬细胞M2型极化的新标记4.2通过BMDM的RNA-Seq数据验证OIT3系巨噬细胞M2型极化的新标记4.3通过生物实验证实OIT3介导巨噬细胞M2型极化实验室诱导BMDM细胞成熟分化与极化,在转录表达和蛋白水平上M2型巨噬细胞OIT3表达最高;同样,在i BMDM细胞极化实验中也有相同的结果。4.4 OIT3介导巨噬细胞极化的功能研究利用慢病毒转染技术在i BMDM细胞系中过表达OIT3,并分别诱导M1型和M2型极化;结果OIT3过表达的M2型极化的巨噬细胞（LV-Oit3-M2）中,m TOR和AMPKa的表达均上调,部分抗炎因子和脂代谢关键酶等均表达上调。5.OIT3介导巨噬细胞极化促进肝癌进展5.1巨噬细胞中OIT3的表达可能调控肿瘤细胞的侵袭转移将悬浮肿瘤细胞H22与i BMDM共培养,发现LV-Oit3-M2中促转移分子Mmp2和Mmp9及促血管生成分子Vegf和Pdgf的转录表达均明显上调;同时发现侵袭与转移相关蛋白Vimentin和Snail在LV-Oit3-M2共培养的H22细胞中表达最高。5.2巨噬细胞中OIT3的表达促进肝癌细胞的迁移与侵袭利用Transwell培养体系,在迁移实验中,与LV-Oit3-M2共培养组穿过滤膜的Hepa1-6细胞最多;在侵袭实验中,与LV-Oit3-M2共培养组同时穿过滤膜和基质胶的Hepa1-6细胞也最多。5.3巨噬细胞中OIT3的表达促进肿瘤进展采用裸鼠皮下荷瘤实验,将裸鼠分为H22+PBS注射的空白对照组,H22+Mock-i BMDM等比混合注射的阴性对照组和H22+LV-Oit3-i BMDM等比混合注射的实验组,结果发现实验组中肿瘤生长最快、体积最大、重量与瘤体重比最高。结论与思考:1.本研究建立了一个基于CCNB1和ANXA10的转录表达、TNM分期及BMI等多个因素的Nomogram预后模型;该模型适用性强,可用于HCC主要致病因素的芯片及RNA-Seq数据。2.本研究揭示了HIF1A氧稳态调节、VEGF信号及Th2细胞的浸润与HCC不良预后有关,而EC在HCC进展中可能存在破坏和增生的双重作用。3.聚焦于HCC癌旁组织中浸润的肿瘤相关免疫细胞,本研究推测红色模块基因集中的OIT3可能是M2型巨噬细胞的新型生物标记分子,强调了癌旁组织在TME研究中不可忽视的作用。4.本研究发现并验证了OIT3分子系M2型巨噬细胞的新型生物标记,初步探究了OIT3在重编程巨噬细胞的极化特征及代谢特征中的关键作用。5.本研究明确了OIT3过表达的巨噬细胞可促进肝癌细胞的迁移与侵袭及肿瘤进展,为探究靶向巨噬细胞的免疫治疗,改善HCC患者的预后提供了一个新的潜在靶点。