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目的心肌缺血再灌注损伤(MIRI)在冠心病急性心肌缺血事件中的主要病理表现是缺血缺氧导致的心肌细胞损伤。最新研究表明：自噬对MIRI起“双刃剑”作用。mTOR介导的mTOR/自噬互反馈和Beclin 1介导的自噬/凋亡互反馈可能是调控自噬“双刃剑”转向促细胞存活的重要机制。我们前期研究证实苗药都木油活性成分荭草苷抗心肌缺血再灌损伤的作用机制可能与抗凋亡和诱导自噬有关。在此基础上,本研究拟通过建立大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,探寻荭草苷(Orientin, Ori)防治MIRI的主要作用靶点,验证“荭草苷抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的核心是通过调节mTOR与Beclin 1双通路,诱导细胞适度自噬,促使自噬“双刃剑”作用转向细胞保护”的假说,为苗药都木油防治MIRI提供药理学依据。方法和结果首先采用胰酶消化法体外分离培养大鼠乳鼠心肌细胞,利用三气培养法建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型(缺氧12h,复氧12 h)。实验共分为7组：正常对照组(Control组)、缺氧/复氧损伤组(HR组)、低剂量荭草苷预处理组(3 μmol/L, Ori-3组)、中剂量荭草苷预处理组(10μmol/L,Ori-10组)、高剂量荭草苷预处理组(30μmol/L, Ori-30组)、荭草苷+自噬抑制剂组(30μmol/L荭草苷+100 nm Wortmannin, OW组)以及阳性对照药白藜芦醇组(5 μmol/L, Res组)。药物预孵育心肌细胞12h后,再行缺氧/复氧处理。本研究共分为四部分探讨荭草苷抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的分子机制。1.荭草苷抗大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的药效学研究通过光镜检测心肌细胞形态学改变、CCK-8法检测心肌细胞活力、生化分析仪检测培养基中心肌酶活力、电镜检测心肌细胞超微结构改变等来评估心肌细胞损伤程度,并进行荭草苷抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的药效学研究。结果发现：与Control组比较,HR组心肌细胞活力下降约50%,比较结果具有统计学差异(P<0.001)；培养基中LDH和CK-MB活性均明显高于Control组(P<0.001)；光镜以及电镜下均观察到HR组心肌细胞发生了病理性改变,这表明缺氧/复氧处理对心肌细胞造成了较大程度损伤。在荭草苷预处理组,心肌细胞活力较HR组均有所升高(P<0.001);培养基中LDH和CK-MB活性则明显下降,与HR组比较差异显著(P<0.001)；高剂量荭草苷能明显改善缺氧/复氧损伤心肌细胞的病理学改变；这些实验结果均表明预给药荭草苷能明显减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,对心肌细胞起到保护作用。在OW组,与Ori-30组比较,缺氧/复氧处理后心肌细胞活力下降约22%(P<0.001),培养基中LDH和CK-MB活性则明显上升(P<0.001),心肌细胞的病理学损伤程度与HR组相似,这些结果表明Wortmannin的加入减弱了荭草苷对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。2.荭草苷对缺氧/复氧损伤心肌细胞内自噬与凋亡的影响通过Annexin V/ PI双染流式细胞仪法和TUNEL法检测心肌细胞凋亡以及Western Blot检测Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达水平来判断心肌细胞凋亡程度,通过电镜检测心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体、激光共聚焦显微镜检测LC3点聚现象以及Western Blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和Beclin 1蛋白表达水平等来评估心肌细胞自噬程度,并研究荭草苷对缺氧/复氧损伤心肌细胞内凋亡与自噬的影响。结果发现：与Control组比较,HR组心肌细胞凋亡率明显上升(P<0.001)；抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平也有增加的趋势；在HR组心肌细胞内还可发现LC3点聚现象及自噬体数量增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例及Beclin1表达水平也都有上升趋势；这些实验结果表明缺氧/复氧损伤能明显增强心肌细胞凋亡水平以及诱导心肌细胞自噬。与HR组比较,中高剂量荭草苷能明显抑制缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡；且心肌细胞内Bcl-2的蛋白表达水平随荭草苷剂量增加有上升趋势,在Ori-30组心肌细胞内Bcl-2蛋白表达水平是HR组的1.7倍(P<0.01)；这些实验结果表明荭草苷可通过上调Bcl-2来抑制缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡。而各组心肌细胞内Bcl-XL的蛋白表达水平无明显差异。与HR组比较,Ori-30组内LC3阳性细胞率上升至62%(P<0.05),心肌细胞内自噬体数量明显增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例及Beclin 1的表达水平也进一步增强,表明荭草苷可显著诱导心肌细胞自噬。与Ori-30组比较,OW组心肌细胞凋亡水平明显上升(P<0.001),而Bcl-2蛋白表达水平则明显下降,表明Wortmannin减弱了荭草苷的抗细胞凋亡作用。与Ori-30组比较,OW组心肌细胞内LC3点聚现象和自噬体数量明显下降,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化以及Beclin 1的表达水平也都减少,说明Wortmannin抑制了荭草苷诱导的心肌细胞自噬。3.荭草苷基于mTOR相关信号通路的抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的分子机制研究通过Western Blot检测Akt、AMPK、mTOR和p70S6K等mTOR相关信号通路上关键蛋白质的表达水平及磷酸化水平,研究mTOR相关信号通路在荭草苷调控自噬中的作用机制。结果发现：与HR组比较,Ori-30组心肌细胞内Akt蛋白磷酸化水平较高(P<0.05),而在OW组,其Akt蛋白磷酸化水平明显低于Ori-30组(P<0.05),表明高剂量荭草苷可通过PI3K-Akt信号通路发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用。与HR组比较,在中高剂量荭草苷预处理组心肌细胞内mTOR在Ser2448和Ser2481位点的磷酸化水平均降低(P<0.01或P<0.001),Raptor蛋白表达水平和p70S6K磷酸化水平也都明显下降(P<0.001),而AMPK磷酸化水平则随荭草苷剂量升高而有上升趋势,表明荭草苷可通过激活AMPK而抑制mTORC1活性。与Ori-30组比较,OW组心肌细胞内mTOR的磷酸化水平和p70S6K的磷酸化水平均升高,表明Wortmannin可以减弱荭草苷通过抑制mTORC1诱导的自噬。随荭草苷剂量升高,Rictor蛋白表达水平明显降低(P<0.001 vs.HR组),说明荭草苷能抑制mTORC2活性。4.荭草苷基于Beclin 1/Bcl-2相互作用的抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的分子机制研究通过Real-Time PCR检测beclin 1的mRNA表达水平研来究荭草苷对beclin 1基因转录的调控；通过Western Blot检测Beclin 1、Bcl-2和Bcl-XL的磷酸化水平以及免疫共沉淀法检测内质网上Beclin 1/Bcl-2的结合程度,研究荭草苷对Beclin 1/Bcl-2相互作用的调控。结果发现：与HR组比较,Ori-30组心肌细胞内beclin 1基因的mRNA表达水平明显上升(P<0.05),而与Ori-30组比较,OW组beclin 1基因的mRNA表达水平有下降趋势,表明高剂量荭草苷能通过调控beclin 1的基因转录参与心肌细胞自噬的调控。与HR组比较,在荭草苷预处理心肌细胞内Bcl-2在Ser87位点以及Bcl-XL在Ser62位点的磷酸化水平均有所降低,表明荭草苷可抑制Bcl-2和Bcl-XL的磷酸化；而Beclin 1在Ser234和Thr119位点的磷酸化水平均有所升高,表明荭草苷可诱导Beclin 1在Ser234和Thr119两个位点的磷酸化。与HR组比较,免疫共沉淀实验结果发现荭草苷预处理可显著提高Beclin 1与Bcl-2的结合程度。结论1.荭草苷能对缺氧/复氧损伤的心肌细胞起到保护作用,且呈剂量依赖性；荭草苷能明显增强缺氧/复氧损伤心肌细胞的活力,减少心肌细胞内LDH和CK-MB的漏出,并能明显改善缺氧/复氧损伤心肌细胞的形态学和超微结构改变。2.荭草苷对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用与激活PI3K-Akt信号通路有关,其可能的保护机制之一是通过活化Akt而磷酸化Beclin 1 的Ser234位点,进而阻止Beclin 1介导的心肌细胞过度自噬。3.荭草苷可通过上调Bcl-2表达水平来抑制缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡。4.荭草苷可通过AMPK-mTORC1信号通路诱导心肌细胞适度自噬发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用。5.荭草苷还可通过抑制Bcl-2和Bcl-XL磷酸化而增强内质网上Beclin1与Bcl-2的结合程度,从而阻止Beclin 1介导的心肌细胞过度自噬。