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家蚕(Bombyx mori)是一种重要的经济昆虫,也是研究昆虫变态发育和遗传进化的经典模式昆虫。激素和营养的协同调控对昆虫的生长发育有着重要作用。Myc基因广泛参与细胞活动,能调控细胞生长,并同时受到Ras信号和蜕皮激素(20E)信号的调控,影响组织及个体发育。研究家蚕Myc同源基因BmMyc的功能,对幼虫组织和个体的生长发育以及提高蚕丝产量有着重要的理论意义和应用价值。本论文从RaslCA转基因家蚕后部丝腺组织转录组数据分析入手,研究家蚕BmMyc对20E信号通路相关基因的转录调控作用。结合转录组学研究和实时荧光定量PCR实验(qRT-PCR),验证在家蚕后部丝腺中Ras1CA对BmMyc、20E信号通路基因的调控作用；运用生物软件对BmMyc的序列信息进行分析,利用半定量逆转录PCR对BmMyc基因的时空表达进行分析；通过体外细胞表达实验、体内杆状病毒超表达和RNAi实验研究BmMyc对20E信号基因的影响,基因表达检测均采用qRT-PC R。通过本研究以期揭示在家蚕变态发育过程中,BmMyc在营养信号对蜕皮信号调控机制中起到的作用。研究主要内容和结果如下：1.基于RNA-Seq验证分析RaslCA在家蚕后部丝腺的转录水平调控分析转录组数据发现,Ras1CA转基因家蚕后部丝腺组织中,细胞周期信号通路基因、20E信号通路基因和BmMyc基因的表达均受到调控。分别选取细胞周期信号通路中编码细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)、细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞分裂周期基因(Cdc/Cdh)和转录因子等蛋白的基因:dk1、cdk4/6、cdk2、 cdcD1、cycD2、cdc7、cdhl和dp-1,2进行qRT-PCR验证,结果表明Ras1CA超表达后部丝腺中,所选基因表达均显著上调,与转录组基因表达丰度(FRKM)上调趋势一致；检测BmMyc基因发现其转录水平也显著上调,与转录组数据上调趋势一致；检测20E信号通路中EcR-B、USP、E75、E74、BrC、EcR-A、Ftz-f1和Hr3基因,发现基因表达显著下调,与转录组数据下调趋势一致。2. BmMyc基因生物信息学分析及时空表达谱根据NCBI已登录BmMyc基因信息,克隆获得相同序列,对其进行生物信息学分析,结果如下：BmMyc基因cDNA全长序列为1970bp,开放阅读框长度为1130bp,共编码376个氨基酸,预测其蛋白分子量为42.7kD,理论等电点为6.69,不稳定指数为70.44,脂肪族指数为69.97；BmMyc蛋白的总平均疏水性系数为-0.888,表现出明显的亲水性；预测发现没有信号肽,说明该蛋白为非分泌型蛋白；预测分析该蛋白亚细胞定位到核的系数达到0.88,为核定位蛋白；分析发现BmMyc含有一个高度保守的螺旋-环-螺旋(HLH)的保守功能域。检测BmMyc基因在家蚕幼虫头部、表皮、血液、马氏管、中肠、气管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢10种组织中的表达量,结果显示,该基因在丝腺组织中表达量较高,性腺中表达量较低,其他组织中差别不大。检测从蚕卵至成虫各个发育节点BmMyc基因的表达,发现从1龄至5龄,BmMyc表达量随家蚕的生长发育而逐渐上升,蛹至成虫期表达量降低。检测BmMyc基因在后部丝腺组织中的发育变化水平,结果显示,4龄眠期表达量最高,5龄表达水平随进食减少逐渐降低,游走期最低,预蛹期第2天略微上升。3.Bm12细胞中BmMyc超表达对20E信号通路基因的转录调控研究构建家蚕Bml2细胞表达载体pIEX4-BmMyc,超表达BmMyc基因,其转录水平上升约6000倍,检测20E信号通路基因E’cR-B、USP、E75、E74、BrC、 EcR-A.Hr3和E93的表达,发现受到20%-40%的抑制作用,差异显著。进一步共转染启动子载体,利用双荧光素酶报告系统检测,结果显示EcR基因启动子活性受到显著抑制,usp、E75和BrC基因启动子活性并未受到影响,表明BmMyc通过结合EcR启动子,抑制转录表达。超表达BmMyc基因后添加20E处理,EcR-B1和E75基因表达量回升,20E挽救了EcR-B1和E75基因的表达。4.家蚕体内BmMyc杆状病毒超表达和RNAi对20E信号通路基因的影响构建杆状病毒表达载体pFast-BmMyc和Bacmid-BmMyc,在Sf9细胞中制备病毒,注射P2代病毒于5L3D幼虫体内,幼虫表皮出现病变现象,表明侵染成功,统计注射96h和120h后的发育表型,结果显示侵染BmMyc病毒的幼虫在发育至游走期(96h)和预蛹期(120h)时有25%左右的个体生长时间延长,发育推迟。检测基因变化发现BmMyc基因超表达约百倍,20E信号基因EcR-B、USP、E75、E74、BrC、EcR-A、Hr3和E93的表达显著下调,约有30%-50%。为进一步研究BmMyc基因对20E相关基因的转录抑制功能,进行RNAi干扰,体外合成dsRNA后注射于5L7D幼虫体内,检测后部丝腺和脂肪体组织基因表达变化,结果显示BmMyc基因有约50%的干扰效果,差异显著,usp.BrC和EcR.B基因转录水平显著上调,结果与超表达结果相对应。综上所述,在家蚕后部丝腺中BmMyc能够抑制20E信号通路相关基因的表达,具有转录抑制功能,参与家蚕幼虫变态发育等生理过程中的转录调控。