猪圆环病毒2型间接ELISA试剂盒以及免疫试纸条的研制

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抗原猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type, PCV2)能够引起猪断奶后多系统衰竭综合症(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。随后发现猪皮炎肾病综合症(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(Porcine respiratory disease complex, PRDC)、先天性震颤(Congenital tremor, CT)等疾病也与PCV2感染有关。因此,PCV2可给生猪生产带来直接和间接损失,是一个重要的经济性致病因子。PCV2的两个主要开放阅读框ORF1和ORF2,分别编码病毒复制相关蛋白Rep和病毒衣壳蛋白Cap。其中,Cap蛋白石PCV2病毒的主要结构蛋白,具有多个抗原位点,在抗病毒免疫中起到重要作用。本研究以大肠杆菌表达的重组Cap蛋白为抗原,研制间接ELISA试剂盒,并以兔/鼠抗重组Cap蛋白多抗研制免疫胶体金检测试纸。研究内容及成果包括:1应用大肠杆菌原核表达系统重组表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,该融合蛋白具有良好的免疫原性,可作为间接ELISA试剂盒的包被抗原。2以纯化的pET32a-Cap融合蛋白为包被抗原,优化条件,建立了间接ELISA检测方法;同时与包括猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)在内的多种临床常见病毒无交叉反应。3利用已建立的猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,研制出了猪圆环病毒2型间接ELISA检测试剂盒,可用于猪圆环病毒2型的流行病学调查以及临床诊断。将试剂盒初步用于实验室保存的临床血清检测,结果显示安徽、江苏等地的猪场PCV2病毒抗体的阳性率都非常高,应引起足够重视。4将纯化得到的pET32a-Cap融合蛋白复性后免疫新西兰家兔和ICR小鼠,制备两种来源的pET2a-Cap融合蛋白多克隆抗体。两种多抗纯化后经检测,具有良好的免疫原性,能够用于下一步研制猪圆环病毒2型免疫胶体金层析试纸。5用纯化的pET32a-Cap融合蛋白兔多抗和鼠多抗制备免疫胶体金层析试纸,并分别用Tris-HCl和粗体的PCV2病毒液进行测试,结果该试纸出现了预想的反应变化,说明该试纸在经过一定的优化后,能够用于临床PCV2病毒的检测。该方法具有简便易行、简单快速、低成本等特点,特别适合临床的推广与普及。
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