研究目的研究哺乳动物早期视觉发育期间谷氨酸能视网膜波对视网膜内ON、OFF系统分离修饰作用的突触特点及突触机制。研究方法1.采用生后8天和生后10-12天的ChAT-Cre-GCamp3小鼠视网膜,观察对比ON、OFF ChAT-band的钙依赖性电活动在第二、三视网膜波阶段的特点和差异;2.采用生后10-12天的ChAT-Cre-Tdtomato小鼠,应用全细胞双膜片钳技术,观察第三阶段视网膜波ON、OFF SAC在电压钳模式下兴奋性突触输入的时空模式的特点,比较时间模式的差异;3.应用药理学方法观察相关受体或通道对第三阶段视网膜波ON、OFF SAC时间模式的影响;4.应用膜片钳全细胞记录技术结合光遗传学方法,使用蓝色LED光源特异性激活mGluR6-ChannelRhodopsin-2小鼠视网膜ON双极细胞,观察ON系统的激活对不同类型神经节细胞的作用,结合药理学方法探讨可能的突触机制。研究结果1.ON、OFF ChAT-band的自发性钙依赖性电活动的时间模式在第二阶段视网膜波时期呈现同步化,在第三阶段视网膜波时期呈现非同步化,且遵循特定的时间顺序即ON在OFF之前,时间差异为743.31±190.75ms(n=4 retina,25 waves)。2.第三阶段视网膜波在ON、OFF SAC中发生的起始时间相对一致但呈现主波和副波两个波形:ON SAC为一大一小即主波在前副波在后,OFF SAC为一小一大,副波在前主波在后。主波波峰出现的时间在ON、OFF两个SAC中呈现非同步化,但遵循一个特定规律:即每次ON SAC的主波波峰的出现时间都先于OFF SAC,时间差为829.85±282.78(n=14 pairs);并且ON SAC的主波与OFF SAC的副波对应、ON SAC的副波与OFF SAC的主波对应,有相对一致的起始和结束时间。3.第三阶段ON GC视网膜波的起始时间、波形都和ON SAC大致吻合;OFF GC则和OFF SAC类似,OFF GC主波波峰在ON SAC之后,表现出和ON、OFF SAC相似的时间差异;ON-OFF GC则有两个主波,第一个主波和ON SAC的主波基本重合,第二个主波紧跟其后。4.甘氨酸能受体阻滞剂STR可以同步化第三阶段视网膜波ON、OFF SAC时间模式,STR联合GABA受体阻滞剂PTX可以起到协同作用,单纯PTX、缝隙连接阻滞剂18-betaGA不能改变ON、OFF SAC非同步化模式。5.单纯激活ON双极细胞可以诱发神经节细胞"视网膜波样"的反应:ON神经节细胞在ChR2反应结束后出现一个类似于副波的小波;OFF神经节细胞则在ON型双极细胞被激活时,受到某种抑制作用,表现为较小水平的去极化形成类似于副波的小波,当ChR2反应结束后,出现一个类似主波的反应幅度较大的波;ON-OFF GC表现为两个主波的双相波形。ON、OFF、ON-OFF RGC在ChR2反应结束后所诱发的内向电流可以被STR阻断。研究结论1.视网膜ON、OFF系统的修饰作用始于视网膜波第三阶段。在视网膜内ON、OFF系统各自独立的通路结构已经形成的基础上,视网膜波的兴奋性递质从乙酰胆碱过渡到谷氨酸,视网膜波对视网膜内ON、OFF系统的修饰作用才会启动。2.第三阶段视网膜波能够对视网膜内ON、OFF细胞进行非同步化修饰,这种修饰作用不仅作用于输出细胞还作用于输出细胞上游的中间神经元。3.ON、OFF细胞在第三阶段视网膜波期间表现出不同的时间模式和空间模式。这种时空差异由突触前机制所介导。4.视网膜波通过随机的、反复的、转换神经递质等方式使相同类型输出细胞同步化,不同类型输出细胞先后经历同步化与非同步化,对视网膜向高级视觉中枢的输出进行修饰、重塑与改建以引导高级中枢内在视觉发生以前视觉环路的精确修饰。5.在阻断了抑制性神经递质γ-氨基丁酸和甘氨酸传递后,来自ON、OFF双极细胞的兴奋性驱动是同步化的。甘氨酸对第三阶段视网膜ON、OFF系统分离起重要调控作用。6.第三阶段视网膜波时期,ON双极细胞通过甘氨酸能抑制性通路抑制OFF双极细胞的兴奋性释放,继而产生ON、OFF细胞反应的非同步化。