胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤,c-kit或血小板源性生长因子受体α (platelet-derived growth factor receptor a, PDGFRA)受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)的异常激活是其发生的关键因素。目前治疗以手术为主,对于中高危及复发的患者靶向药物甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate-Glivec)是一线治疗药物,但大部分患者仍会发生耐药。因此,寻找具有共性的c-kit/PDGFRA下游关键信号通路或者c-kit/PDGFRA信号通路以外有与之交叉的信号通路上的相关分子,可能为GIST靶向治疗提供靶点。Sonic hedgehog (Shh)信号转导通路在肿瘤的发生、发展过程中起到重要作用。阻断肿瘤细胞中的Shh信号转导通路某个节点,有可能为肿瘤的靶向治疗提供一个新的途径。GIST组织中Shh信号通路的表达已有报道,但Shh与GIST临床病理因素及预后关系、Shh与GIST细胞增殖、凋亡的关系以及Shh在GIST中具体的作用机制及与其他信号通路的交叉调控的尚未见报道。因此,本研究将集中阐述上述三个方面的内容。为探讨Shh信号通路在GIST发生和发展过程中的作用,验证其作用的可能机制是在GIST中与PI3K和MAPK信号通路存在交叉联系,本课题采用免疫组化检测GIST标本中Shh信号通路中重要蛋白(Shh, Ptch, Smo和Gli-1)的表达,分析其与GIST病理因素及复发预后等因素的相互联系,Western blot检测GIST组织中Shh通路、PI3K通路和MAPK通路的表达情况,分析三条信号通路表达的关联性；体外培养GIST-H1细胞株,用相应的信号刺激因子(EGF、N-Shh)刺激上述三条信号通路,分别或联合用靶向抑制剂(cyclopamine、wortmannin和PD98059)对三条信号通路进行抑制,检测抑制后信号通路的关键因子(Gli-1、 p-AKT及p-ERK)表达变化,验证上述三条信号通路在GIST中是否存在相互之间的交叉调控,以及在GIST抑制增殖和促进凋亡过程中起作用。初步探讨Shh信号通路在GIST中的作用机制及联合抑制Shh和PI3K信号通路、MAPK通路对肿瘤凋亡和增殖的作用,为靶向治疗奠定基础。第一部分Shh信号通路分子在胃肠道间质瘤组织中的表达及其与临床病理因素的关系目的：探讨GIST标本组织中Shh信号通路重要蛋白的表达及其与临床病理因素之间的关系。方法：收集安徽医科大学第一附属医院2001年1月至2008年12月间行手术治疗,资料完整的GIST患者125例。免疫组化检测Shh信号通路蛋白Shh, Ptch, Smo和Gli-1的表达情况,分析上述蛋白的表达与GIST的肿瘤部位、直径、核分裂像、NIH分级、复发及预后的关系。结果：GIST组织中Shh,Ptch, Smo和Gli-14种蛋白的表达率分别为90.5%%,83.3%,85.7%,85.7%；Shh表达水平与Smo、Gli-1表达水平均成正相关,Ptch表达水平与Smo表达水平呈正相关；Smo表达水平与Gli-1表达水平成正相关,Shh表达水平与Ptch表达水平无相关性；Ptch表达水平与Gli-1表达水平无相关性；Shh, Ptch, Smo和Gli-1四种蛋白的阳性表达水平与患者性别、年龄均无相关性,与肿瘤大小、核分裂像数和危险度分级有关。Smo和Gli-1的阳性表达还与原发肿瘤的部位、组织学分类有关；NIH分级为中、高危组的GIST中Shh, Ptch, Smo和Gli-1四种蛋白的阳性表达率明显高于NIH分级为极低、低危组的阳性表达率,差异有显著性。Shh, Ptch, Smo和Gli-1在复发GIST中的阳性率明显高于无复发GIST,差异有显著性。Shh, Ptch, Smo和Gli-1四种蛋白的表达为阳性组的1、3、5年生存率要显著低于表达为阴性组者。进一步的多因素分析发现,Gli-1的阳性表达是患者预后的独立危险因素。结论：GIST组织中,有Shh信号通路的存在并激活,Shh信号通路的重要蛋白在GIST中表达具有相关性,可能是通过配体依赖型的激活方式参与GIST的发生与发展。Shh信号通路蛋白的表达与GIST预后及复发有关,其中Gli-1蛋白的表达可能作为判断复发的重要指标之一。第二部分胃肠道间质瘤组织中Gli-1、p-AKT、 p-ERK的表达及意义目的：分析Shh、PI3K和MAPK信号通路中的关键因子Gli-1、p-AKT和p-ERK在GIST组织中的表达情况,探讨上述三条信号通路表达之间的相关性。方法：收集安徽医科大学第一附属医院在2013年1月至2013年12月间手术切除、资料完整的GIST石蜡组织标本145例,Western blot检测GIST组织中Gli-1、p-AKT及p-ERK的表达水平,分析上述三种蛋白的表达及其相关性。结果：Gli-1、p-AKT和p-ERK在不同危险度分级的GIST中均有表达,且其表达水平与肿瘤的危险度分级密切相关,表达具有一致性。结论：Shh、PI3K和MAPK信号通路的关键因子Gli-1、p-AKT和p-ERK,广泛表达于GIST中,上述信号通路参与了GIST的发生发展过程。Shh信号通路在GIST中所起作用可能是通过与PI3K通路和MAPK通路之间的交叉调控机制实现的。第三部分胃肠道间质瘤中Shh与PI3K、MAPK信号通路的交叉调控及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响目的：探讨GIST中Shh, PI3K和MAPK三条信号通路之间是否存在交叉调控及其对细胞增殖和凋亡的影响。方法：采用N-Shh和EGF分别诱导激活GIST-H1细胞株,分别使用各个信号通路的特异性抑制剂阻滞相应的信号通路。Western blot方法检测各个通路的关键因子Gli-1、p-AKT和p-ERK在的表达情况。分析单独使用或联合使用Shh、PI3K/AKT和MAPK通路的抑制剂对于未激活及激活状态下的各信号通路活性的影响；分析使用上述通路抑制剂阻断对于GIST-H1细胞增殖、凋亡的影响。结果：GIST-H1细胞株中,p-AKT, p-ERK和Gli-1的表达水平能分别被EGF和N-Shh刺激上调；EGF诱导GIST-H1细胞株p-AKT或p-ERK表达效应可分别被wortmannin或PD98059所抑制,同时这种效应也能够被cyclopamine抑制,联合使用两种抑制剂(cyclopamine+wortmannin,或cyclopamine +PD98059)能更进一步抑制上述通路的活性；N-shh诱导GIST-H1细胞株Gli-1表达效应可被cyclopamine抑制,同时这种效应也分别能被wortmannin或PD98059所抑制,联合使用两种抑制剂(cyclopamine+wortmannin,或cyclopamine+PD98059)能更进一步抑制Shh通路Gli-1的活性；在EGF处理下,GIST-H1细胞增殖速度显著加快,并且该促进能被PD98059和cyclopamine-KAAD预处理部分抑制,在N-Shh处理下,GIST-H1细胞的增殖速度显著加快,并且该效应能被PD98059和cyclopamine-KAAD预处理所部分抑制；Shh、PI3K和MAPK1信号通路特异的抑制剂可以诱导GIST-H1细胞凋亡。结论：GIST细胞中,Shh、PI3K;和MAPK信号转导是存在的,且存在相互之间的交叉联系。联合使用上述信号通路的抑制剂可以协同抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,可作为GIST靶向治疗的新选择。