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香加皮(Corex Periplocae)为萝蘑科植物杠柳(Periplocca sepium Bge.)的干燥根皮,收载于《中国药典》2005年版(一部),主要用于治疗风湿性关节炎,有毒,服用不当极易产生中毒反应,主要表现为恶心、呕吐、腹泻等胃肠道症状,以及心率减慢、早博、房室传导阻滞等。本研究以香加皮为研究对象,对其化学成分、质量控制方法、心脏毒性、有毒成分的体内药动学和代谢组学等进行了研究,内容如下：采用现代分离纯化技术,对香加皮进行化学成分的提取分离。利用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、凝胶柱色谱和制备HPLC等分离、纯化手段,从药材的70%乙醇提取物的氯仿萃取层和正丁醇萃取层共分得8个化合物,利用化学方法和光谱学技术鉴定其结构,分别是羽扇豆醇(lupeo1)、异香草酸(isovanillic acid)、异香草醛(isovanillin)、北五加皮苷M (periplocoside M)、杠柳毒苷(periplocin)、杠柳苷元(periplogenin)、2-羟基-5-(2-羟基-4-甲氧苄基)-4-甲氧基苯甲醛(2-hydroxy-5-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)-4-methoxybenzaldehyde)和蔗糖(sucrose)。其中包含了具有强心苷母核的化合物杠柳毒苷和杠柳苷元。根据文献报道,这两种成分是香加皮产生心脏毒性作用的主要成分,因此化学成分的获取为香加皮毒性成分的研究提供了物质基础。对香加皮质量控制方法进行了研究。采用HPLC-DAD法,以乙腈-0.05%磷酸水为流动相梯度洗脱,在220 nm波长条件下同时测定19批不同来源的药材中异香草酸、异香草醛、杠柳毒苷、4-甲氧基水杨醛和2-羟基-5-(2-羟基-4-甲氧苄基)-4-甲氧基苯甲醛5种成分的含量。结果表明不同来源的药材中含量差异较大。本研究还采用HPLC-DAD法建立了香加皮的高效液相色谱指纹图谱。以杠柳毒苷为内参比峰,共标示了18个共有峰,指认了其中5个,分别为异香草酸、异香草醛、杠柳毒苷、4-甲氧基水杨醛和2-羟基-5-(2-羟基-4-甲氧苄基)-4-甲氧基苯甲醛。建立了相似度评价标准,为香加皮的质量控制提供了依据。采用生理学方法对大鼠心功能和心电图进行监测,考察香加皮对心脏的毒性作用。将大鼠随机分为4组,分别为低(3 g·kg-1)、中(6 g·kg-1)、高(12 g·kg-1)剂量药材提取液给药组和空白对照组。连续给药三天,进行测定。结果表明,低、中、高剂量下香加皮可以明显降低心率(HR)；升高大鼠左心室收缩峰压(LVSD)和左室内压上升的最大速度(+dp/dtmax)；降低大鼠左室舒张期末压(LVEDP)和左室内压下降最大速度(-dp/dtmax)。说明香加皮可使大鼠心肌收缩强度增大,降低心肌的舒张性能。对大鼠心电图的研究表明,中、高剂量下香加皮可使P-R、Q-T间期缩短,低剂量下差异不明显；而低、中、高剂量均可使R-R间期延长。同时,大鼠给药后还出现了正性肌力作用和负性频率作用,S-T段降低呈鱼钩状,这是临床上判断是否服用强心苷的依据之一,验证了香加皮中含有的强心苷类成分就是其心脏毒性作用的主要成分。建立了代谢组学研究的UPLC-MS/MS方法。色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column (50 mm×2.1 mm,1.7μm);流速：0.30 mL·min-1；柱温：35℃；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱；MS：ESI离子化模式,m/z 150～900范围内正离子全扫描模式；气流：600 L·h-1；温度：350℃；毛细管电压：3000V。应用建立的UPLC-MS/MS方法对给药前后不同时间点的大鼠血样和尿样通过沉淀蛋白处理后进行分析,将得到的原始数据经Masslynex等统计软件处理,进行PCA分析。从Score图可以看出给药前后大鼠的总体代谢物差异明显,可以得到很好的区分,且结果显示给药后大鼠可以自身调节,但在短期内不能完全恢复；Loading图中远离原点的质荷比能够直观的表示出生物样品中发生变化的重要的内源性代谢物。通过提取离子的准确质荷比和二级裂解碎片推测了血浆中8个标记物中4个的结构,分别为十六-二氢鞘氨醇(Hexadecasphinganine)、溶血卵磷脂LPC(18：2)、溶血卵磷脂LPC(20：4)、溶血卵磷脂LPC(16：0)和溶血卵磷脂LPC(18：0)；推测了尿液样品中9个标记物中4个的结构,分别为马尿酸(Hippuric acid)、苯乙酰甘氨酸(Phenylacetyglycine)、植物鞘氨醇(Phytosphingosine)和十六-二氢鞘氨醇(Hexadecasphinganine)、其中十六-二氢鞘氨醇是血浆和尿液样品中所共有的。针对所确定的生物标记物,推测了产生心脏毒性的机制,即鞘氨醇的变化可能导致心肌细胞中1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)的改变,溶血卵磷脂的变化可能与心肌细胞膜整体结构的改变有关。建立了LC-MS法对香加皮中毒性成分杠柳毒苷的体内药动学方法。以地高辛为内标,经过乙酸乙酯萃取后进行分析。色谱柱为Kromasil C18 Column(150 mm×4.6 mm,5μm)：流动相为甲醇-水(76：24,v/v)：流速为0.8 mL·min-1；分流比为1：3；进样量为10μL；离子源为电喷雾电离源(ESI源)；接口温度为400℃：CDL温度250℃；加热块温度200℃；雾化气(N2)流速2.5 L.min-1；干燥气(N2)流速2.0 L·min-1；检测电压1.5 kv；正离子方式检测；扫描方式为选择离子监测(SIM),用于定量分析的离子分别为m/z 719.50(杠柳毒苷)和m/z 803.50(内标地高辛)。结果表明,大鼠灌胃给予杠柳毒苷单体后,其血浆中并不能监测到杠柳毒苷的存在。为了能够揭示杠柳毒苷的体内行为,进一步对大鼠尾静脉和肌肉注射两种给药方式进行了研究,主要药动学参数如下：Tmax(h)分别为0.033和0.112±0.054,Cmax(ng·mL-1)分别为313.6±122.3和254.4±108.3,T1/2(h)分别为0.507±0.187和0.351±0.088,AUC0-t(gg·h·L-1)分别为79.18±16.38和145.4±26.6,AUC0-∞(μg·h·L-1)分别为84.6±21.0和147.8±26.0,CL/F(L·(h·kg)-1)分别为4.081±1.022和2.281±0.361,MRT(h)分别为0.444±0.125和0.519±0.098。结果表明,在两种给药方式下,大鼠的药动学参数除达峰时间(Tmax)外,其余均无显著性差异(P>0.05)。杠柳毒苷在大鼠体内消除较快,结合其口服无吸收的现象,对杠柳毒苷的体内代谢进行了进一步的研究。采用UPLC-MS/MS方法对大鼠口服杠柳毒苷后的尿样、粪样和胆汁等样品进行了排泄研究。色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column (50 mm×2.1 mm,1.7μm);流速为0.30 mL.min-1；柱温：35℃；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱。共检测到包括原型药在内的5种代谢产物,其质荷比与保留时间分别为：m/z 719(3.12min),m/z 535(3.07 min),m/z 391(3.01 min),m/z 551(3.08 min),m/z 407(2.93 min)。参照保留时间和二级质谱裂解规律,对检测到的5种代谢产物结构进行了推测,分别为杠柳毒苷、杠柳次苷、杠柳苷元、12-羟基化杠柳次苷和12-羟基杠柳苷元。