目的：本研究拟构建针对OPN的质粒表达载体,转导高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经Blasticidin筛选获得稳定转导细胞。评价OPN稳定沉默对乳腺癌细胞生长、增殖和转移等生物学行为的影响,并从OPN基因沉默对肿瘤细胞乏氧程度、HIF-1和VEGF表达的影响等各个方面探讨OPN基因沉默对乳腺癌放化疗敏感性的影响。　　 方法：　　 1.构建靶向OPN的RNAi干扰质粒:从GeneBank下载OPNmRNA基因序列,利用相应软件设计RNAi用单链寡核苷酸。按照试剂盒说明书构建转导质粒。　　 2.细胞转染和稳定细胞株的筛选分别转导MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞,经Blasticidin10～14d筛选,直至对照组未转导细胞中无存活细胞,而转导细胞株中存活的即为OPN基因沉默细胞。对OPN基因沉默细胞进行扩大培养。　　 3.乏氧处理:将转染组和对照组细胞放入乏氧箱内,乏氧条件为:37℃5％CO20.5％02,24h后提取蛋白。　　 4.照射处理:转染细胞和对照细胞按照射剂量梯度逐步稀释,接种于6孔板。接种个数分别为200、400、1000、2000。照射条件为:6MV-X射线(6MV-X线直线加速器,PHILIP),照射野为20×20cm,源皮距lOOcm,照射剂量分别为:0、2、4、6Gy。2～3周后做克隆分析。　　 5.转导细胞体外生物学特性检测:Real-timeRT-PCR和Western-Blot分别在mRNA和蛋白水平鉴定OPN、HIF-1和VEGF蛋白质在细胞内的表达。划痕试验、MTT法及细胞衰老实验比较亲本细胞与OPN基因沉默细胞的集、落形成能力和增殖能力差异。Transwell体外侵袭实验比较细胞侵袭转移潜能。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的差异。克隆形成试验比较转导细胞与亲本细胞的放射敏感性差异;MTT法比较转导细胞与亲本细胞对化疗药物（阿霉素）敏感性的差异。　　 结果：成功构建乳腺癌细胞OPNRNA干扰质粒,经转染筛选获得乳腺癌OPN稳定沉默细胞株;MDA-MB-231细胞转染后与MDA-MB-231细胞相比,转染细胞株MDA-MB-3430PNmRNA和蛋白质的表达量均显著下调;细胞周期S期比率MDA-MB-231、MDA-MB-neg和MDA-MB-343分别为21.10％、22.77％和43.67％,S期出现明显阻滞;凋亡率转染组由3.61％提高到4.91％:细胞衰老实验结果显示OPN基因沉默组细胞衰老进程加剧;MTT法细胞增殖活性明显下降:OPN基因沉默细胞MDA-MB-343、对照组细胞MDA-MB-231和MDA-MB-neg组24h的A值分别为0.3611±0.0152,0.4161±0.1831,0.4078±0.1471;48h为0.4494±00189,0.616l±0.03014,0.5950±0.03740;72h为0.5022±O.03538,0.7428±0.04182,0.7389±0.04086;96h为0.5683±0.03595,0.7906±0.04597,0.7950±0.4535。OPN基因沉默细胞MDA-MB-343的生长速度明显减慢,各组间细胞的A值相比差异均有显著性(方差分析,24hF=20.249,P＜O.01。48～96hF值分别为:55.625,73.165,55.355,P＜O.01),其中OPN基因沉默细胞组与亲本细胞组和阴性对照组相比统计学具有显著性差异(p＜0.01)。表明靶向OPN基因沉默表达后乳腺癌细胞的增殖分裂能力明显下调。乏氧处理后对照组OPN的表达增加,OPN基因沉默组受到抑制。放射处理对OPN基因沉默蛋白质表达的影响无统计学意义。OPN基因沉默组经乏氧处理后与放化疗抗拒相关的HIF-l和VEGF的表达量显著下调。细胞凋亡率转染组由3.61％提高到4.9％,2Gy照射后对照组和OPN基因沉默组对应的凋亡率分别为13.g％和24.07％。Transwell试验穿过聚碳酸酯膜的细胞MDA-MB-231、阴性对照和OPN基因沉默组分别为46.20±5.13/HP、47.64±4.61/HP、35.86±4.79/HP,侵袭力降至75.27％。2Gy照射后分别为38.93士4.9l/HP,40.87±4.57/HP,21.87±5.06/HP,侵袭力迸一步降至45.g％。细胞衰老实验结果显示OPN基因沉默组2Gy照射后细胞的衰老进程明显加剧。OPN基因沉默组细胞克隆存活率为对照组的3g％(p=0.000)。2Gy照射后对照组和OPN基因沉默组的克隆存活分数分别为0.6和0.45。对应的1％克隆存活剂量分别为5.60Gy和4.94Gy。OPN基因沉默组肿瘤细胞对阿霉素(doxorubicin)的化疗敏感性IC50为0.13588ug/ml,未转染组和阴性对照分别为0.83869ug/ml和0.79652ug/ml.,化疗敏感性提高了近6.17倍。　　 结论：OPNRNAi显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231mRNA和蛋白质的表达,调控细胞周期时相分布,加速细胞凋亡和衰老进程,抑制细胞增殖;OPNRNA干扰后在常氧和乏氧状态下通过有效抑制MDA-MB-231细胞mRNA和蛋白的表达,从而抑制了HIF-1和VEGF的表达;OPNRNAi提高了MDA-MB-231细胞的放射敏感性及对阿霉素的化疗敏感性。OPN可能是增强乳腺癌放化疗敏感性的潜在靶点。