[目的]肾细胞癌（Renal cell carcinoma,RCC）,是成人肾脏最常见的恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的2%,发病率在泌尿系统恶性肿瘤中排第三,仅次于膀胱癌和前列腺癌,但致死率是泌尿系肿瘤中最高的。虽然目前外科切除是治疗非转移性RCC的金标准,但是RCC发病隐匿,早中期几乎无任何临床症状,约有30%的病例在确诊时已有局部侵犯或远处转移,并且对于接受手术治疗的肾细胞癌患者,术后3年内局部复发率仍能达到20%-30%,所以RCC的辅助治疗是临床上综合治疗RCC的重要部分。与大多数恶性肿瘤不同的是,RCC对于放疗和化疗是不敏感的,因此RCC的辅助治疗的中,生物免疫治疗是重要的手段。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK cells）是一类通过IL-2,OKT3,IFN-γ等细胞因子刺激外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）而获得明显抗肿瘤活性的一群免疫细胞,是肿瘤非特异性细胞免疫治疗的一种有效手段,在体内、体外实验及临床研究中都取得了较好的疗效。然而,目前尚未完全清楚在细胞因子的诱导下单核细胞是如何获得抗肿瘤活性的,并且CIK细胞疗法最重要的临床转化问题是CIK细胞的标准制备方法是否是一种高效的策略,能否在最短时间内最大限度的获得具备高活性的杀瘤功能细胞。因此,提高CIK细胞的增殖活性以及抗肿瘤效应是CIK应用亟待解决的技术问题,而CIK细胞抗肿瘤作用机制是需要解决的科学问题。在CIK细胞的制备过程中,IFN-γ、IL-2和CD3是主要的用于刺激CIK细胞形成的细胞因子,但为了改进CIK细胞功效,也有许多研究尝试加入不同的细胞因子,如IL-1,IL-17和IL-12等,以获得更优化和高效的CIK细胞。IL-15是一种与IL-2结构同源的T细胞活化因子,能有效促进T细胞、NK细胞的活化和增殖。此外,IL-15还可以使被抗原激活的T细胞在到达效应细胞阶段之前提前转变为记忆性T细胞,并通过维持记忆性T细胞在体内长期存活而促进免疫反应的持续性。基于IL-15对T细胞特殊的调控活性,我们在传统CIK细胞制备流程的基础上加入IL-15获得了增强型CIK细胞（CIKIL-2+IL-15）,在前期研究中获得了较好的抗肿瘤效果。本课题将基于增强型CIK细胞对RCC的作用及机制,研究CIKIL-2+1L-15细胞的增殖活性及体外体内对RCC细胞抗肿瘤活性变化。与此同时通过转录组测序,筛选增强型CIK细胞抗肿瘤活性调控的关键基因;然后针对筛选出的关键基因对CIKIL-2+IL-15细胞功能的影响和内在机制进行系统研究,进一步阐明CIKIL-2+IL-15细胞的抗肿瘤机制。最后进行了 CIKIL-2+IL-15细胞治疗肾细胞癌的初步临床研究,为CIKIL-2+IL-15细胞的临床应用提供科学依据及技术支持。[方法]第一部分:CIK IL-2+IL-15 细胞的增殖活性及对RCC的抗肿瘤活性研究:1.通过常规方法和改良方法分别制备普通CIK细胞（CIKIL-2）和增强型CIK细胞（CIK IL-2+IL-I5）,对比两种CIK细胞的增殖活性,流式细胞检测两种CIK细胞的CD3+,CD8+和CD56+细胞分群情况。2.分别通过体外实验和体内实验研究增强型CIK细胞对RCC的抗肿瘤活性及机制。体外实验:CCK8检测两种CIK细胞对于RCC细胞ACHN的细胞毒活性,采用ELISA实验检测两种CIK细胞分泌的细胞因子,电镜观察增强型细胞杀伤ACHN细胞超微观结构。体内实验:通过皮下注射ACHN肿瘤细胞构建ACNH异种移植瘤小鼠模型,尾静脉及瘤内注射增强型CIK细胞验证其体内抗RCC肿瘤活性。肿瘤组织进行免疫荧光染色（TUNEL,Ki-67和CD3）,了解瘤体局部增强型CIK细胞浸润及ACHN细胞增殖与凋亡情况。第二部分:CIK IL-2+IL-15细胞抗RCC的内在机制研究:1.提取增强型CIK细胞与普通CIK细胞的RNA进行全转录组测序,通过GO（gene ontology）及KEGG富集分析测序数据,筛选得到增强型CIK细胞中差异表达的关键基因（黏附分子CD2,CD11a和CD56）。2.运用siRNA干扰分别获得低表达CD2,CD11a和CD56的增强型CIK细胞（CIKCD2-low、CIKCD11a-low及 CIKCD56-low）。并将 CIKCD2-low、CIKCD11a-low及 IKCD56-low细胞的RNA进行全转录组测序,测序数据经过Venn分析筛选出CIKCD2-low、CIKCD11a-low及CIKCD56-low细胞共有的差异基因,再通过GO及KEGG功能富集分析在共有差异基因中筛选出可能与CIK细胞免疫调控相关的下游基因（趋化因子 CXCL16,CXCR6,CCL5,CCR4）。通过 qRT-PCR验证 CIKCD2-low、CIKCD11a-low及CIKCD56-low细胞中上述趋化因子的转录水平差异,并通过PPI（protein-protein interaction）分析最终得出黏附分子CD2,CD1 1a及CD56共同调控增强型CIK细胞生物学活性的信号通路及关键蛋白分子功能网络。3.通过体外及体内实验及细胞因子检测对比CIKCD2-low、CIKCD11a-low及CIKCD56-low细胞与增强型CIK细胞的抗RCC肿瘤活性差异,验证CD2,CD11a及CD56促进增强型CIK细胞的抗肿瘤作用。第三部分:CIK IL-2+IL-15细胞治疗肾细胞癌的临床研究:对11例肾细胞癌患者进行CIK IL-2+IL-15细胞治疗,并与另外9例非CIK细胞治疗患者对比。通过比较两组的总生存期（OS）,无进展生存期（PFS）及CT影像学差异观察增强型CIK细胞的临床疗效。[结果]第一部分:增强型CIK细胞（CIK IL-2+IL-15）在增殖能力上明显高于普通CIK细胞（CIKIL-2）,CD3+CD56+细胞亚群比例也显著高于CIKIL-2细胞。CIK IL-2+IL-15细胞在体外及体内抗肿瘤实验中进行都显示出对肾细胞癌具有更强的抗肿瘤能力。在体外研究中CIK IL-2+IL-15对肾癌细胞ACHN的细胞毒活性明显更强,细胞因子颗粒酶B,TNF-α和IFN-γ的分泌水平也更高。电镜扫描观察到增强型细胞通过伪足包裹ACHN细胞,并与其紧密黏附。体内实验中,CIK IL-2+IL-15对ACHN肾细胞癌荷瘤裸鼠具有明显的抗肿瘤活性,通过免疫荧光染色观察到组织局部肿瘤细胞增殖减少,凋亡增加,CIK IL-2+IL-15细胞浸润。第二部分:转录组测序分析发现黏附分子CD2,CD11a和CD56在增强型CIK细胞中转录表达上调。通过siRNA干扰CIK IL-2+IL-15细胞,成功获得CIKCD2-low、CIKCD11a-low 及 CIKCD56-low 细胞。对 CIKCD2-low、CIKCD11a-low 及 CIKCD56-low细胞转录组测序的结果进行Venn分析,并通过Metascape进行功能富集分析,发现黏附分子CD56,CD11a和CD2通过与趋化因子CXCL16,CXCR6,CCL5,CCR4等相互作用共同调控CIK IL-2+IL-15细胞的抗肿瘤活性。进一步PPI网络分析提示上述黏附分子与趋化因子通过PI3K/Akt与MAPK信号转导通路发挥生物学活性。体外实验证实这三种CIK细胞对ACHN及其他六种成人常见恶性肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性明显减弱,细胞因子IFN-y及Perforin分泌减少。同时体内研究发现CIKCD2-low、CIKCD11a-low及CIKCD56-low细胞对ACHN细胞在裸鼠体内成瘤过程的抑制作用减弱。第三部分:临床研究中,11例术后接受增强型CIK细胞辅助治疗的肾细胞癌患者与另外9例仅接受手术治疗的患者对比发现两组无进展生存期（PFS）差别不明显,但增强型CIK治疗可以稳定肺部转移灶,延长患者的带瘤生存时间,进而延长患者总生存期（OS）。接受增强型CIK治疗的患者耐受性良好,治疗期间无明显不良反应。[结论]1.增强型CIK细胞（CIKIL-2+IL-15）相比普通的CIK细胞（CIKIL-2）有着更强的增殖能力及抗RCC活性,通过IFN-γ、TNF-α,穿孔素、颗粒酶等细胞因子介导肿瘤细胞凋亡,在体外体内抑制RCC的存活与生长。与此同时,我们还观察到电镜扫描下增强型CIK细胞与ACHN细胞之间的细胞黏附可能是增强型CIK细胞抗肿瘤活性的一部分。2黏附分子CD2,CD11a和CD56促进增强型CIK细胞的抗肿瘤活性,抑制CD2,CD1 1a和CD56的转录表达导致增强型CIK细胞的抗肿瘤活性减弱以及细胞因子IFN-γ和Perforin的分泌减少。黏附分子CD2,CD1 1a和CD56对增强型CIK细胞的调控是通过与趋化因子CXCL16,CXCR6,CCL5,CCR4等相互作用,经PI3K/Akt与MAPK信号转导通路共同介导CIK细胞归巢,识别并粘附肿瘤细胞,发挥抗肿瘤免疫活性。3.在肾细胞癌的临床研究中,增强型CIK细胞辅助治疗可延缓肿瘤的进展,稳定肺部转移灶,延长患者的带瘤生存时间,进而延长患者总生存期（OS）。可以成为RCC辅助治疗的一个安全有效的选择。