地鳖虫纤溶活性先导蛋白抑制肿瘤新生血管形成与作用机制研究

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地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)又名土元,地鳖虫,属蜚蠊目(Blattaria)鳖蠊科(Corydiidae)真鳖蠊属(Eucorydia),具有破血逐瘀、续筋接骨、消炎散结、舒经活血和疗伤止痛等重要药用功效。临床主要用于瘀血阻滞,症瘕积聚,跌扑损伤等症。现代药学研究表明,地鳖及其提取物具有显著活血化瘀与抑瘤功效。本论文以传统中药材雌性地鳖虫(Eupolyphaga sinensis Walker)为原料,通过PBS磷酸缓冲液匀浆、浸提,硫酸铵分段盐析沉淀和DEAE-52纤维素离子交换层析等分离纯化方法,从其体内分离纯化得到一种纤溶活性蛋白组分,地鳖纤溶活性蛋白(Fibrinolyric Protein of Eupolyphaga sinensis Walker,EFP),采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法对其进行了分子量测定,SDS-PAGE结果显示其分子量为别为79.2KDa,采用考马斯亮蓝G-250法测得其中的蛋白含量为13.6%;硫酸-蒽酮法测定糖含量为85.6%。采用纤维蛋白平板法测定EFP纤溶活性,测得其纤溶活性为23U/mg。前期试验证明,地鳖纤溶活性蛋白(EFP)具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。本论文通过体内实验,构建荷瘤小鼠模型,药物实验分为阳性对照组(环磷酰胺),阴性对照组(生理盐水),药物高浓度组、中浓度组和低浓度组。通过免疫组织化学法检测S180和H22荷瘤小鼠肿瘤组织的微血管密度(MVD),酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量。用小鼠制备EFP含药血清,用含10%含药血清的培养基培养细胞,MTT法检测EFP含药对细胞体外增殖的抑制作用。ELISA法检测细胞培养液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的含量。凯基银染法检测地鳖纤溶活性蛋白含药血清对细胞端粒酶活性的影响。结果显示,EFP药物组的MVD均小于生理盐水组,同样的药物组VEGF的表达均低于生理盐水组。EFP含药血清对人脐静脉内皮细胞、肺癌、乳腺癌细胞有显著抑制作用, ELISA法检测结果表明EFP含药血清对人脐静脉内皮细胞、肺癌、乳腺癌细胞的VEGF和bFGF表达均有抑制作用。
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