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我们之前的研究发现,来自 GTKO/hCD46(α1,3-galactosyltrans-ferasegene knockout and human complement regulatory protein CD46,α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除并表达人类补体调节蛋白CD46)基因修饰猪脂肪组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有较弱的异种免疫原性,体外共培养环境下,不会引起人的淋巴细胞对其产生明显的免疫应答反应,然而,关于GTKO/hCD46猪脂肪来源的MSC对人T细胞具体的免疫调节作用机制尚不明确。基于文献报道及之前的研究我们提出以下几点假想,即GTKO/hCD46 pMSC可能通过1)诱导人T细胞发生凋亡;2)抑制T细胞的活化;3)诱导调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的产生等方式来抑制人T细胞的免疫应答。研究目的和方法:为了进一步评估体外环境下,GTKO/hCD46 pMSC分别对人CD4+T和CD8+T细胞的免疫调节作用并探讨可能存在的作用机制,本实验将从以下几方面开展:第一部分:实验所用细胞包括猪脂肪组织来源MSC(porcine adipose-derived MSC,pMSC)和腹主动脉来源的内皮细胞(porcine aortic endothelial cells,pAEC)的提取和培养,并通过诱导分化实验和对干细胞分子标记物的检测对pMSC进行鉴定。第二部分:将提纯后的人CD4+T和CD8 + T细胞分别与pMSC pAEC或两者同时进行体外混合细胞培养(mixed lymphocyte reaction,MLR),通过检测T细胞结合的DNA合成前体(3H-胸腺嘧啶核苷)的比率来评估T细胞的增殖程度,最终结果将以每分钟脉冲数(counts per minute,CPM)来表示;此外,在传统基础上建立两步法MLR,评估共培养后滤除pMSC的情况下T细胞的免疫状态;第三部分:通过流式细胞术检测混合培养之后pMSC对人T细胞的活化、凋亡、颗粒酶的表达以及对调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的诱导等方面的影响,从而对探讨GTKO/hCD46 pMSC对人T细胞的免疫调节机制。第四部分:通过免疫印记法进一步对可能影响T细胞增殖的信号转导和转录激活因子 5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的活化情况进行检测,并分析STAT5在MSC发挥其免疫调节作用中的价值。研究结果:第一部分:由GTKO/hCD46猪脂肪组织可以有效地获取大量的成纤维细胞样的细胞集落贴壁生长。流式细胞术鉴定表达常见的干细胞分子标记物,经诱导分化实验显示具备向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。第二部分:在与人T细胞进行共培养之后,CD4+T和CD8+T的增殖反应较弱,与T细胞单独培养组结果无显著差异(P>0.05),以pAEC与T细胞培养作为阳性对照,pMSC和pAEC同时与T细胞共培养,可显著抑制T细胞的增殖反应(P<0.05),并呈现剂量依赖的趋势。两步法MLR提示,共培养结束后去除GTKO/hCD46pMSC,CD4+T细胞仍可以维持对异种抗原(GTKO pAEC)的低反应状态,而CD8+T细胞则可以迅速恢复免疫增殖状态。第三部分:1)以GTKOpAEC共培养组作为对照,GTKO/hCD46pMSC能够显著地降低CD4+T和CD8+T细胞上颗粒酶B的表达水平(P<0.05),而pMSC共培养组T细胞中CD4 +CD25 +Foxp3hi T细胞的比例无显著性升高,(P>0.05)。T细胞单独培养组和pMSC共培养组发生凋亡的T细胞比例分别为0.53±0.25%vs0.57±0.35%,两者之间没有显著性差异(P>0.05)。GTKO/hCD46 pMSC对于T细胞活化因子CD25和LAG-3的表达没有显著性的影响,却能够明显的上调T细胞CD69的表达(P<0.01)。第四部分:人T细胞在与GTKO/hCD46pMSC与共培养之后,细胞内信号转导和转录激活因子 5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的磷酸化比率显著高于T细胞单独培养组(P<0.05)研究结果:1)GTKO/CD46 pMSC能够由GTKO/hCD46猪脂肪组织有效地获取,细胞能够贴壁生长,并呈成纤维细胞样的细胞集落;2)GTKO/CD46 pMSC在体外共培养条件下,能够有效地抑制CD4 +和CD8 + T细胞的增殖,抑制作用表现为剂量依赖性,并且MSC对于CD4 +T的免疫调节作用相对于CD8+T细胞更加持久。3)GTKO/CD46pMSC对于T细胞的免疫调节不是通过诱导Treg也不是诱导T细胞发生凋亡的途径来实现;4)GTKO/CD46 pMSC可能通过上调细胞CD69表达进而影响下游STAT5信号传导途径,并最终实现对T细胞增殖的抑制作用。