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第一部分:诱导性多能性干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞及差异表达MicroRNAs的筛选目的:筛选出hiPSCs体外诱导分化为多巴胺能神经神经前体细胞过程中表达有差异的microRNAs,与经典WNT信号通路进行比对分析筛选到miR-125a-5p。方法:分组:1)实验组:LSB/SHH/FGF8b/CHIR99021+N2/B27诱导组;2)对照组:单纯N2/B27诱导组。在体外将hiPSCs向多巴胺能神经前体细胞方向进行诱导分化,免疫细胞化学、实时定量PCR(qRT-PCR)法检测hiPSCs向DA能神经前体细胞分化过程中不同阶段细胞:神经前体细胞标志物Nestin、底板细胞标志物Foxa2、DA能神经前体细胞标志物En1、神经元标志物Tuj1及DA能神经元标志物TH的表达。提取实验组hiPSCs、神经前体细胞、DA能神经前体细胞3个阶段的细胞的总RNA进行microRNAs高通量测序,筛选出差异表达的microRNAs,与经典WNT信号传导通路进行相关性分析筛选出适当的microRNA用于研究。结果:在诱导分化过程中,神经前体细胞(NPCs)阶段(诱导分化第7天)细胞基本为NESTIN+细胞,底板细胞标志物FOXA2的表达实验组明显增高,且有统计学意义(P<0.001),诱导分化第25天多巴胺能前体细胞标志物EN1、LMX1A及MSX1的表达也有明显的增高(P<0.01),早期神经元阶段TH的表达实验组较对照组明显增高(P<0.01)。MicroRNAs高通量测序结果显示,在诱导分化的第0天、第7天、第25天存在差异递增表达的microRNAs,将差异递增的microRNAs与经典WNT信号通路进行相关性分析,筛选到miR-125a-5p能够通过靶向APC直接作用与经典WNT信号传导通路。结论:HiPSCs能在体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞,不同阶段的细胞中存在microRNAs的差异表达。与经典WNT信号通路进行比对分析发现:miR-125a-5p在hiPSCs,hiPSCs源性NPCs,hiPSCs源性DA能神经元上呈递增表达。第二部分:MiR-125a-5p靶向APC激活经典WNT信号通路促进hi PSCs向DA能神经前体细胞的分化目的:通过过表达miR-125a-5p,下调其靶基因APC的表达,并进一步调节经典WNT信号通路活性,实现人诱导性多能干细胞(hi PSCs)向多巴胺(DA)能神经前体细胞的高效诱导分化。方法:双荧光素酶报告基因法的miR-125a-5p的靶基因APC进行验证;miR-125a-5p前体miR-125a慢病毒载体的构建与包装,miR-125a-5p过表达hi PSCs细胞株的构建、筛选与建系,及其向多DA能神经前体细胞与DA能神经元的诱导分化;免疫细胞化学、实时定量PCR(q RT-PCR)及蛋白印迹(WB)法检测miR-125a-5p过表达hi PSCs与对照hi PSCs向DA能神经前体细胞及DA能神经元诱导分化过程中神经前体细胞标志物Nestin、底板细胞标志物Foxa2、DA能神经前体细胞标志物En1、DA能神经前体细胞分选标志物Corin、神经元标志物Tuj1及DA能神经元标志物TH的表达。结果:双荧光素酶报告基因结果显示miR-125a-5p靶向调节经典WNT信号通路关键因子APC(P<0.01)。稳定过表达miR-125a-5p的hi PSCs能进一步诱导分化为DA能神经前体细胞及DA能神经元,其诱导分化效率较对照hi PSCs诱导分化组明显增高,表现为:诱导分化第7天腹侧底板细胞标志物FOXA2表达明显增高(P<0.05)、诱导分化第14天多巴胺能前体细胞标志物EN1、CORIN的表达明显增高(P<0.01),诱导分化第25天神经元阶段TH、DAT和Nurr1的表达明显增高,其中TH和DAT的表达量的差异性P<0.01,Nurr1的表达量的差异性P<0.05,提示过表达miR-125a-5p的hi PSCs具有更好的向DA能神经前体细胞的诱导分化潜能。结论:MiR-125a-5p能通过靶向下调APC的表达激活经典WNT信号通路活性,促进hi PSCs向DA能神经前体细胞及DA能神经元的诱导分化。