[研究背景和目的]急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床上常见的危重病,起病急剧,发展迅速,病情凶险,预后恶劣,死亡率高,发病机制复杂,目前临床上缺乏有效的治疗措施。因此,寻找新的治疗策略是目前临床上治疗ALI亟待解决的重要问题。肺泡上皮细胞丧失和过度凋亡是ALI发展过程中的重要事件,决定ALI发生、发展和预后,在ALI发生、发展过程中起重要作用。因此,抑制肺泡上皮细胞凋亡和促进肺泡上皮修复被认为是目前ALI治疗的重要目标和作用的细胞靶点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多功能干细胞,目前被认为是一种较为理想的治疗性细胞,在细胞替代治疗、器官组织的修复、再生和重构以及基因治疗等方面具有广阔临床应用前景。新近研究表明,输入外源性或迁移的内源性干细胞(stem cells)能定植在损伤的肺组织内,参与受损的肺组织的修复和重构,能够治疗ALI/ARDS.肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(chrocnic obstructive pulmonary disease, COPD),这为急、慢性肺部疾病治疗提供了新的策略和新思路。然而,干细胞治疗急、慢性肺部疾病作用和机制尚不清楚。综上所述,我们认为BMMSC可以作为ALI的治疗性细胞,推测其治疗作用和机制可能与抗炎症、抗肺水肿、抗凋亡及其旁分泌效应有关。为了证明这-假说,本研究在LPS诱导的小鼠ALI模型上研究BMMSC抗炎症、抗肺水肿和抗凋亡作用,在肺泡Ⅱ细胞与BMMSC共培养体系上研究BMMSC抗肺泡Ⅱ上皮细胞凋亡的旁分泌效应机制,为呼吸性疾病提供新的治疗策略和作用的靶点。[研究方法]1.BMMSC体外生长生物学特性研究方法(1)采用全骨髓贴壁法体外分离培养BMMSC;(2)光学显微镜下计数细胞生长数量、观测细胞培养形态和定向诱导分化的细胞形态；(3)流式细胞仪分析BMMSC表面标志物和细胞周期。2.在整体水平上,研究BMMSC的抗炎、抗水肿和抗凋亡作用的评价方法：(1)气管内滴注LPS建立急性肺损伤小鼠模型,实验随机分为3组(每组n=18只)：①对照组：经气管滴注PBS,30min后尾静脉注射100μl的PBS；②损伤组：经气管滴注LPS,30min后尾静脉注射100μ1的PBS；③治疗组：经气管滴注LPS,30min后尾静脉注入100μl BMMSC的PBS悬液;(2)Gustavo Matute-Bello病理学评分方法光镜下观察肺组织损伤程度；(3)血气分析仪检测动脉血氧分压(PaO2)；(4)荧光显微镜下观察BMMSC在肺内的定植；(5)常规方法测定肺湿干(W/D)比值；(6)ELISA测定肺组织髓过氧化物酶水平和肺泡灌洗液(BALF)中IL-6、TNF-a、IL-10含量；(7)考马斯亮蓝(CBB)染料结合法测定BALF中蛋白含量;(8)血细胞计数仪检测BALF中中性粒细胞数量；(9)TUNEL原位检测肺组织细胞凋亡率；(10)免疫组化染色检测肺组织肺泡上皮细胞caspase3、bcl-2和bax表达水平;(11)透射电镜观察肺泡Ⅱ性上皮细胞凋亡。3.在细胞水平上,研究BMMSC抗肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡作用机制的评价方法(1)选用人肺泡上皮细胞株(A549细胞株)与人骨髓间充质干细胞株(第3代hBMMSC株),建立Transwell非接触分层共培养体系。实验分4组(每组6孔,5×106细胞/孔)：①空白对照组,PBS+A549;②LPS损伤组,LPS+A549;③BMMSC对照组,PBS+A549+BMMSC④BMMSC干预组,LPS+A549+BMMSC。(2)Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测A549细胞凋亡率；(3)Western blotting检测A549细胞caspase3、bcl-2和bax蛋白表达水平;(4)透射电镜观察A549细胞凋亡特征性超微结构；(5)ELISA测定共培养液中的KGF、HGF含量；(6)荧光定量PCR检测BMMSC KGF和HGF mRNA水平。[研究结果]1.BMMSC体外生长生物学特性研究结果(1)4-6周龄小鼠BMMSC在5%～10%胎牛血清浓度和5～8×107/L接种密度时生长活力强,生长速度最快,收获细胞数量最多,被设定为获得高浓度、高纯度、高活性的BMMSC的最佳条件；(2)在设定的最佳条件下,体外培养小鼠骨髓BMMSC呈集落性生长,大部分细胞为G0/G1期未分化细胞。细胞形态主要呈梭形,类似成纤维细胞,其表达CD14-、CD34-、CD45和CD90+、CD105+、CD106+,具有贴壁生长特性和多向分化能力,符合间充质干细胞的体外生长的主要生物学特性。2.BMMSC在急性肺损伤中的抗炎、抗水肿和抗凋亡作用研究结果(1)BMMS能够定植于LPS致肺损伤小鼠的肺组织内,减轻LPS致ALI小鼠的肺组织结构损伤程度,提高动脉血Pa02水平；(2)小鼠BMMSC能降低LPS致ALI小鼠的肺组织MPO含量和PMN数量、IL-6和TNF-α水平,提高IL-10含量;(3)小鼠BMMSC能降低LPS致ALI小鼠肺W/D比值和肺泡内蛋白质含量；(4)小鼠BMMSC能够减少LPS致ALI小鼠肺组织肺泡上皮细胞凋亡及促凋亡蛋白caspase3和bax的表达,增加抗凋亡蛋白bcl-2表达。3.BMMSC体外抗肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡作用机制研究结果(1)LPS能体外诱导体外培养的A549细胞凋亡增加,最适的浓度和最佳时间为10μg/ml LPS作用于A549细胞24h;(2)LPS能促进A549细胞促凋亡蛋白caspase-3、bax表达,降低抗凋亡蛋白bcl-2表达；(3)BMMSC能促进A549细胞抗凋亡蛋白bcl-2表达,抑制促凋亡蛋白caspase-3、bax蛋白表达；(4)与LPS诱导的A549细胞共培养,BMMSC能够旁分泌生长因子KGF和HGF,增加KGF和HGF mRNA表达。[结论]1.在设定的4-6周龄小鼠,5%-10%胎牛血清浓度和5-8×107/L接种密度的最佳条件下,小鼠BMMSC表达CD14-.CD34-.CD45和CD90+.CD105+.CD106+,具有贴壁生长特性和多向分化能力,符合间充质干细胞体外生长的主要生物学特性。2.小鼠BMMSC可定植在LPS致ALI小鼠的肺组织内,能减轻其肺组织结构损伤程度和改善肺功能,具有抗炎症反应和抗肺水肿和抗肺泡上皮细胞凋亡的作用。3.与LPS诱导的A549细胞共培养,BMMSC能促进A549细胞表达抗凋亡蛋白bcl-2和抑制促凋亡蛋白caspase-3和bax的表达,增加旁分泌生长因子KGF、HGF和KGF.HGF mRNA表达水平,具有抗细胞凋亡和旁分泌作用。4BMMSC旁分泌生长因子KGF和HGF可能是其抗细胞凋亡作用的机制之一