第一部分应用双向电泳-飞行时间质谱技术分析肝癌血清蛋白质组目的：运用蛋白质组学双向凝胶电泳和飞行时间质谱技术，研究原发性肝细胞癌患者与肝硬化及正常健康个体血清蛋白质组表达图谱的差异，寻找和确定原发性肝细胞癌特征性的血清标志物，为肝癌的临床早期诊断与治疗提供实验室参考依据。方法：收集原发性肝细胞癌患者、肝硬化患者与正常人血清标本各25例，血清预处理除去白蛋白和免疫球蛋白，双向凝胶电泳的第一向电泳采用固相pH梯度电泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析血清蛋白质组成分。电泳后经银染或考马斯亮蓝染色，ImageMaster双向凝胶电泳软件分析，将有意义的差异蛋白质点胶内胰蛋白酶解，经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析肽质量指纹图谱，数据库搜索鉴定蛋白质。在验证组血清标本(包括26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)和组织标本(包括10例肝癌及癌旁组织、6例正常肝组织)中应用Western blotting和RT-PCR方法进行差异蛋白mRNA和蛋白表达水平的验证。应用生物信息学技术对差异蛋白进行结构和生物学功能分析和预测。结果：1．原发性肝细胞癌患者血清与肝硬化及正常健康个体血清相比较，经双向凝胶电泳软件分析，共找到33个差异表达的蛋白质点，分布在图谱中的5个区域内。通过数据库检索分析和鉴定后发现，同一个区域的蛋白质均为同一种蛋白。与肝硬化和正常人比较，血清白蛋白(去除后的部分残留)、血清转铁蛋白、CD5抗原类蛋白(IgM相关肽)在肝细胞癌中低表达，锌-α2糖蛋白(ZAG)和免疫球蛋白γ-1链C区在肝细胞癌中高表达。此外，本项研究还对双向电泳的关键步骤进行了改进和优化，得到了较好的效果。2．经血清免疫印迹验证分析，肝癌血清中锌-α2糖蛋白(ZAG)表达与肝硬化、正常人比较明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。其中，26例ZAG蛋白高表达的肝癌病例中包括5例AFP阴性(AFP＜20ug／L)肝癌患者和6例小肝癌(直径≤3cm)肝癌患者。肝癌组织的RT-PCR和Westem blotting验证结果显示，ZAGmRNA和ZAG蛋白的表达在肝癌组织中明显高于癌旁组织和正常肝组织，以β-actin作为内对照，差异有统计学意义(P＜0.05)。3．对锌-α2糖蛋白的生物信息学分析显示，ZAG基因定位于染色体7q22.1，ZAG蛋白为分泌性蛋白，从蛋白序列和结构上看，其结构上有一个和Ⅰ型MHC肽段结合凹槽相似的大凹槽，在这个凹槽中包含了一种非肽段的化合物，这可能和正常或病理条件下的脂类代谢相关。ZAG是一种新的脂类动员因子，促进降脂作用，在癌性恶病质形成中起作用。小结：1．根据蛋白质不同的分子量和等电点，通过双向凝胶电泳技术可将人血清中蛋白质成分进行分离，并可利用分析软件，找到不同疾病状态下血清中的差异蛋白质。2．原发性肝细胞癌与肝硬化、正常人相比，在血清蛋白质组成分中存在差异。血清白蛋白(去除后的部分残留)、血清转铁蛋白、CD5抗原类蛋白(IgM相关肽)在肝癌中低表达，锌-a2糖蛋白和免疫球蛋白γ-1链C区在肝癌中高表达。其中，CD5抗原类蛋白(IgM相关肽)和锌-α2糖蛋白与肝细胞癌之间的相关性研究目前尚未见报道。本项研究找到的这些差异蛋白质为进一步完善原发性肝细胞癌血清学诊断指标提供了参考依据。3．对锌-α2糖蛋白的初步验证结果提示，其与肝细胞癌密切相关，可作为肝癌早期辅助诊断的潜在血清标记物和可能存在的治疗靶点，值得进一步深入研究。第二部分应用SELDI-TOF MS蛋白质芯片技术分析肝细胞癌血清蛋白质指纹图谱目的：运用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF MS)蛋白质芯片技术检测肝细胞癌患者、肝硬化患者和正常人血清蛋白质指纹图谱表达差异，筛选肝癌特征性血清标志物。为肝癌的临床早期诊断和药物靶点筛选提供可靠的、准确灵敏的实验室参考指标。方法：应用SELDI-TOF MS蛋白质芯片技术检测肝细胞癌患者、肝硬化患者和性别、年龄匹配的正常健康人血清各25例，获得弱阳离子交换(WCX2)蛋白质芯片和疏水型(H4)蛋白质芯片的蛋白质指纹图谱。用BioMarker Wizard、Biomarker Pattem专用软件分析肝癌和肝硬化及正常人血清的差异蛋白质／多肽。用验证组血清标本(26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)对模型进行盲法测试验证，得出判断模型的灵敏度和特异性。应用生物信息学对差异性蛋白／多肽搜索数据库进行初步鉴定。结果：1．应用WCX2芯片和H4芯片在肝癌患者、肝硬化和正常人血清中检测到在不同质荷比处分别有六个和四个差异蛋白质峰。经过BioMarker Wizard软件分析，质荷比(M／Z)为6489Da(P1)、6662Da(P2)、8582Da(P9)、8720Da(P4)、8960Da(P5和P10)处的五个差异蛋白质峰在肝癌组明显低于肝硬化组和正常人组；质荷比为5552Da(P7)、7748Da(P8)、7777Da(P3)、9250Da(P6)处的四个差异蛋白质峰在肝癌组明显高于肝硬化组和正常人组，差异蛋白质峰含量差异有统计学意义。2．利用Biomarker Pattem软件对验证组70例血清标本(包括26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)进行盲法测试，结果发现5552Da、7748Da、7777Da、9250Da这四个多肽组成的预测模型能够对肝癌患者进行鉴别。灵敏度为92.3％(24／26，其中5例AFP＜20ng／ml的肝癌患者中有3例被正确分到肝癌组；6例小肝癌全部被正确分到肝癌组)，特异性为95.5％(42／44)。3．对筛选出的差异多肽进行数据库搜索分别得到了与之分子量最为接近的多肽，分别为：P1：Galanin相关肽，P2：Neuregulin-4，P3：小诱导细胞因子CCL-15，P4：CSL-型锌指包涵蛋白，P5和P10：ATP合酶偶联因子6，P6：泛醌-细胞色素C还原酶复合物线粒体前体，P7：转化生长因子-α前体，P8：成熟T细胞增殖因子-1型A，P9：载脂蛋白A-Ⅱ前体。小结：1．应用SELDI-TOF MS蛋白质芯片技术筛选肝癌患者血清特异性生物标志物的方法快速、有效，操作自动化。建立的诊断模型预测肝癌的灵敏度为92.3％，特异性为95.5％，优于现有AFP和B超等诊断指标。2．检测到的这九种差异蛋白质／多肽可能参与了肝癌的发生、发展过程，有可能成为治疗肝癌的候选药物靶点。3．SLEDI-TOF MS蛋白芯片技术用于分析血清蛋白质组成分的方法灵敏度和特异性均较高，有望成为临床上肿瘤早期诊断的重要检测方法。综合以上两部分的研究结论：1．应用血清蛋白质组学分析方法，寻找可用作肝癌早期诊断或治疗靶点的新的血清标志物，这样的研究思路是可行的。2．应用双向电泳联合质谱技术，分析了肝癌、肝硬化和正常人各25例血清标本，血清白蛋白(去除后的部分残留)、血清转铁蛋白、CD5抗原类蛋白(IgM相关肽)在肝癌中低表达，锌-α2糖蛋白和免疫球蛋白γ-1链C区在肝癌中高表达。锌-α2糖蛋白基因定位于染色体7q22.1，蛋白为分泌性蛋白，与Ⅰ型MHC有高度相似性结构，是一种新的脂类动员因子，促进降脂作用，在肝癌发生、发展中的作用机制有待进一步研究。3．应用SELDI-TOF MS蛋白质芯片技术分析了肝癌、肝硬化和正常人各25例血清标本，肝癌组在质荷比为6489Da、6662Da、8582Da、8720Da、8960Da处的五个蛋白质峰明显减低；肝癌组在质荷比为5552Da、7748Da、7777Da、9250Da处的四个蛋白质峰明显升高。应用5552Da、7748Da、7777Da、9250Da这四个组成的预测模型能够对肝癌患者进行鉴别，灵敏度为92.3％，特异性为95.5％，优于现有AFP和B超等诊断指标。通过数据库搜索，初步鉴定了九种差异多肽。4．通过双向电泳和SELDI-TOF MS蛋白质芯片技术研究血清蛋白质组成分差异，两种方法各有优点和不足。双向电泳方法筛选到的差异蛋白质为分子量中等大小的蛋白质(10KD＜Mw＜100KD)，而SELDI-TOF MS蛋白质芯片技术筛选到的蛋白质多为小分子量的蛋白质或多肽(2KD＜Mw＜20KD)。本项研究找到的这些差异蛋白质和多肽为进一步完善原发性肝细胞癌血清学诊断指标提供了参考依据。血清蛋白质组学技术可以有效、快速地分离和鉴定肿瘤相关蛋白，为肿瘤研究开辟了新的研究思路和方法。