研究背景：　　慢性气道炎症性疾病，如慢性阻塞性肺疾病（ChronicObstructivePulmonaryDisease，COPD）、支气管哮喘等是由多种细胞（如：T淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、气道平滑肌细胞、气道上皮细胞）和细胞组分参与的慢性非特异性疾病[1，2，3]。其主要的病理特点是弥散性气道、肺实质以及肺泡的慢性炎症和结构破坏[1]，最终导致气管管腔狭窄和进行性气道阻力增加，此过程称为气道重塑。人肺成纤维细胞是人类气道黏膜下主要的结构细胞之一，在多种炎症因子的刺激下，肺成纤维细胞可转化成分泌胶原及细胞外基质能力更强的肺肌成纤维细胞[55]。人肺成纤维细胞在气道重塑过程中数量与活性均显著增加，所产生的胶原等细胞外基质亦显著增多，过度表达的细胞外基质在气道壁大量沉积，不仅导致气道壁增厚、僵硬、顺应性下降，还可活化炎症细胞或抑制炎症细胞凋亡[4，5，6]。　　白细胞介素-32（Interleukin-32，IL-32）是一种新发现的细胞因子，基因定位于人类16号染色体P13.3位点，包含8个外显子和6种亚型，包括IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ[2，6，7]，其中以IL-32γ亚型的生物活性最高[8，9，10]。IL-32是一种涉及多种生物功能的细胞因子，包括细胞分化、诱导促炎症因子与抗炎症因子表达、诱导或抑制细胞凋亡等[2，6，7，11]。有研究显示气道慢性炎症疾病中，人肺成纤维细胞的IL-32表达水平增高，由此可见IL-32与气道重塑密切相关。　　整合素（Integrins）是一种细胞表面受体，由18种α和8种β亚单位组成的异二聚体，其中各亚基均包含一个细胞外域、跨膜域以及细胞质域，其表达于不同的细胞表面，参与细胞间、细胞与基质间的信号传递[12，13]，信号通过细胞膜传递活化细胞内的激酶，如局部粘着斑激酶（FocalAdhesionKinase，FAK），活化后的局部粘着斑激酶继而活化下游的信号传导分子，在细胞增生、迁移、粘附、存活以及凋亡等方面发挥重要作用[13，14，15]。最新的研究证实整合素在正常肺组织低表达，在呼吸道疾病患者的肺组织中表达明显升高[13]，也有研究显示敲除整合素αvβ6基因可减缓气道重塑[23]，可见IL-32、整合素、人肺成纤维细胞在气道重塑中关系密切。　　有研究显示，整合素细胞外域能与含RGD氨基酸序列信号分子结合，使整合素发生簇集，细胞外域构象发生改变，引起跨膜域和细胞内域构象改变，整合素α亚基和β亚基之间的盐键破坏，β亚基暴露，局部粘着斑激酶的活化，继而活化下游信号传导通路，在细胞增生、迁移、粘附、存活以及凋亡等方面发挥重要作用[13，14，15]，国外有研究证实IL-32含RGD氨基酸序列[16]。为此，我们猜想IL-32γ可能通过RGD氨基酸序列与整合素结合，并发挥其生物效应。　　近年来国内外大量研究证实了IL-32与气道重塑的密切相关，但绝大部分仅论述了慢性气道炎症、气道重塑患者的血清、肺泡灌洗液、痰液、肺组织中的IL-32较健康对照组升高，但未能解释IL-32在气道重塑过程中的机制。本文旨在研究IL-32γ对人肺胚胎成纤维细胞-1增殖、活化和对整合素-局部黏着斑激酶通路的影响，初步解释IL-32促人肺胚胎成纤维细胞增殖、活化的机制。　　研究目的：　　本课题旨在研究IL-32γ对人肺胚胎成纤维细胞-1增殖、活化的影响和研究IL-32γ对整合素-局部黏着斑激酶通路的影响，初步解释IL-3γ2促人肺胚胎成纤维细胞增殖、活化的机制。　　方法：　　1.人肺胚胎成纤维细胞-1细胞培养于含10％胎牛血清、双抗的高糖DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。　　2.把人肺胚胎成纤维细胞-1按5×103/孔或7.5×103/孔接种于96孔板里孵育6小时，待人肺胚胎成纤维细胞-1贴壁后，吸净培养液，随后加入含不同浓度（0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）的IL-32γ蛋白的培养液。IL-32γ蛋白与人肺胚胎成纤维细胞-1共同培养24小时后（37℃、5%CO2培养箱），每孔加入10μlCCK-8，再置于37℃、5%CO2的培养箱中培养2小时后，用酶标仪测定450nm处的吸光度，并记录数据。　　3.将人肺胚胎成纤维细胞-1按1×106/孔置于6孔板中孵育24小时，细胞贴壁后，吸净培养液，高温灭菌的PBS缓冲液冲洗，随后加入含四个不同浓度（0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）IL-32γ蛋白的培养液。IL-32γ蛋白与人肺胚胎成纤维细胞-1共同培养72小时后（37℃、5%CO2培养箱），再通过蛋白质印迹法（WesternBlot）检测不同浓度IL-32γ刺激下collagen-1和α-SMA两种蛋白的表达水平，以此反映人肺胚胎成纤维细胞活化水平。　　4.将人肺胚胎成纤维细胞-1按1×106/孔置于6孔板中孵育24小时，细胞贴壁后，吸净培养液，高温灭菌的PBS缓冲液冲洗，随后加入含不同浓度（0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）IL-32γ蛋白的培养液。IL-32γ蛋白与人肺胚胎成纤维细胞-1共培养72小时（37℃、5%CO2培养箱），然后提取细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR方法检测整合素αv、整合素β3、整合素β6及局部黏着斑激酶的表达水平。　　结果：　　1.与对照组相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白组），人肺胚胎成纤维细胞-1与IL-32γ共同培养后，其在450nm处的吸光度明显增高（p<0.001），并与IL-32γ浓度呈正相关（r=0.913，p<0.05）。　　2.与对照组相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白组），人肺胚胎成纤维细胞-1与IL-32γ共同培养后，其Collagen-1蛋白和α-SMA蛋白表达水平升高。　　3.与对照组相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白组），人肺胚胎成纤维细胞-1与IL-32γ共同培养后，其表达整合素αv、整合素β3、整合素β6mRNA的RQ值升高（p<0.05），且与IL-32γ蛋白的浓度呈正相关（r=0.888，p<0.01；r=0.924，p<0.01；r=0.947，p<0.01）。　　4.与对照组相比（含0ng/ml的IL-32γ蛋白组），人肺胚胎成纤维细胞-1与IL-32γ共同培养后，其表达局部粘着斑激酶mRNA的RQ明显升高，与IL-32γ蛋白浓度呈正相关（r=0.762，p<0.01）。　　5.在不同浓度IL-32γ影响下，局部黏着斑激酶RQ值的变化与整合素αv、整合素β3、整合素β6RQ值的变化呈正相关（r=0.724，p<0.01；r=0.846，p<0.01；r=0.796，p<0.01）。　　结论：　　1.5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml浓度的IL-32γ可促进人肺胚胎成纤维细胞-1的增殖、活化；　　2.5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml浓度的IL-32γ可促进人肺胚胎成纤维细胞-1整合素αv、整合素β3、整合素β6、局部黏着斑激酶的mRNA表达；　　3.IL-32γ可能通过整合素-局部黏着斑激酶信号通路促进人肺胚胎成纤维细胞-1增殖、活化。