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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是伪狂犬病的病原,给我国乃至全球生猪健康养殖带来了巨大的危害。PRV具有神经侵染性(neuroinvasiveness)和神经毒性(neurovirulence),能够在神经元中建立潜伏感染(latent infection)。PRV经过膜融合进入宿主细胞质后,衣壳-被膜复合体(capsid-tegument complex)沿微管朝着细胞核的方向进行逆行运输(retrograde)。此举的目的在于将病毒基因组运输至细胞核,以进行DNA复制。因此,衣壳-被膜复合体的逆行运输具有重要的生物学意义。胞质动力蛋白(cytoplasmic dynein)是宿主细胞内微管上负责逆行运输的马达蛋白,PRV的逆行运输需要胞质动力蛋白的参与,但其具体机制尚未阐明。本研究利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术筛选了与PRV内层被膜蛋白pUL21相互作用的胞质动力蛋白,发现pUL21通过其羧基端与胞质动力蛋白轻链Roadblock-1互作,并在此基础上开展了进一步的研究,具体内容如下:1 pUL21是PRV的内层被膜蛋白本研究提取纯化了成熟的PRV胞外病毒粒子。在使用表面活性剂和不同浓度的KCl处理病毒粒子后,利用Western blot分析残留在衣壳上的蛋白质成分。结果表明,pUL21与内层被膜蛋白VP1/2一样,都与衣壳紧密连结,不会随着KCl浓度的升高而从衣壳上完全脱离。因此,pUL21是PRV的内层被膜蛋白。2 PRV pUL21与胞质动力蛋白轻链Roadblock-1互作本研究克隆了11个宿主细胞胞质动力蛋白基因,利用双分子荧光互补技术筛选出与PRV被膜蛋白pUL21互作的胞质动力蛋白轻链Roadblock-1;利用免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation,Co-IP)验证了蛋白质的互作;利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)研究了pUL21和Roadblock-1的亚细胞定位,结果表明,pUL21与Roadblock-1在核周的细胞质中共定位;利用截短的方法确定蛋白质的互作区域,发现Roadblock-1与pUL21的羧基端互作。3 pUL21羧基端的功能根据定位蛋白质互作区域的实验结果,本研究利用PRV细菌人工染色体构建了缺失pUL21羧基端的PRV突变株及其回复突变株。在上皮细胞中,缺失pUL21羧基端的PRV增殖滴度不受影响,但传播能力下降;在体外培养的神经元中,缺失pUL21羧基端的PRV在轴突中的逆行运输效率降低,但顺行运输效率不受影响;在动物体中,缺失pUL21羧基端的PRV神经侵染性和毒力受到了一定程度的影响。