肝内胆管癌ICC (Intrahepatic cholangiocarcinoma)约占原位肝癌发生率的10%,近年来已经上升为肝内原发肿瘤导致死亡的第一位。目前认为,肝内胆管癌发生与胆管结石、HBV/HCV感染以及一些其他胆管炎症等因素有关。ICC发病较隐匿,临床症状不典型,较难早期诊断,大部分肝内胆管癌发现时已是晚期,无法手术治疗。即使早期发现手术治疗的,其五年生存率<15-20%。相对HCC而言, ICC同样是多基因参与多步骤协同的复杂病理过程,但对ICC发展过程的了解却远没有HCC深入,因此发现ICC中异常的分子和信号通路,有助于加深对ICC病理发展进程的认识,从而为肝内胆管癌的预防、诊断和治疗提供理论基础。自噬是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程,它通过“自我清除”细胞内无用的、累积的蛋白质聚集物和有缺陷的细胞器等,维持细胞内环境的稳态。在受到饥饿、高温、低氧等外界环境刺激下,细胞通过提高自噬水平,将胞浆内多余组分分解为游离氨基酸、脂肪酸和核苷酸,维持细胞的能量代谢。一些研究表明,自噬能够抑制肿瘤的生长,发挥抑癌基因的作用,自噬相关调控基因Beclin1的失活可以促进裸鼠体外肿瘤的生长,过表达beclin1或atg5能抑制裸鼠乳腺癌模型肿瘤的生长。另一些研究则表明,自噬表达水平的提高能够促进肿瘤细胞在肿瘤内环境各种应激条件下存活和生长。有报道在营养剥夺状态下,即使凋亡被抑制,应用抑制剂间接抑制自噬或是直接使自噬相关基因Beclin1或Atg5等失活,都能阻碍细胞的生长。本研究通过研究肝内胆管癌中自噬的表达情况及其相关功能,并结合相关临床资料分析Beclin1表达与肝内胆管癌发生发展的关系,为进一步研究自噬在胆管癌发生发展中的作用,寻找肝内胆管癌的预后相关分子和治疗靶点提供了实验和理论依据。实验方法：1.应用Western blot技术检测胆管癌细胞系营养缺乏状态下自噬泡标志分子LC3-Ⅱ的蛋白表达水平；2.胆管癌细胞系外转GFP-LC3表达质粒,观察自噬泡的形成；3.电子透射显微镜观察肝内胆管细胞癌组织中的自噬小体；Real-time PCR检测正常肝内胆管上皮组织与肝内胆管细胞癌组织中自噬相关基因的mRNA表达水平；Western blot检测肝内胆管细胞癌组织中自噬泡标志分子LC3-Ⅱ的蛋白表达水平；4.应用自噬抑制剂抑制胆管癌细胞的自噬水平,研究其对胆管癌细胞系生物学特性的影响；5.进行胆管癌细胞系裸鼠体外荷瘤实验,应用自噬抑制剂研究自噬对体外肿瘤生物学特性的影响；6.观察自噬对胆管癌细胞系化疗敏感性的影响；7.构建自噬调控分子Beclin1的干扰病毒,下调胆管癌细胞系Beclin1的内源表达水平,研究其对胆管癌细胞系生物学特性的影响；8.免疫组化检测方法检测肝内胆管细胞癌组织中Beclin1的表达,结合患者临床病理资料及预后资料进行统计分析。结果：1.营养缺乏状态下肝内胆管癌细胞系QBC939、RBE及HCCC-9810自噬活化水平升高；2.肝内胆管癌组织中自噬通路高度激活。自噬相关基因Beclin1、atg5和atg7分别有87.8%、92.68%和85.36%高于正常胆管上皮组织的表达；自噬泡标志分子LC3-Ⅱ有75%高于正常表达；3.应用自噬抑制剂抑制胆管癌细胞的自噬后,胆管癌细胞系在饥饿状态下增殖速度减慢,并且发生凋亡现象；4.自噬抑制剂能够明显抑制体外QBC939细胞裸鼠种植肿瘤的生长；5.抑制自噬可以提高胆管癌细胞系的化疗敏感性；6.内源干扰胆管癌细胞系Beclin1的表达,能够影响饥饿状态下胆管癌细胞周期进程,降低细胞增殖速率,并且提高化疗处理的凋亡发生率；7.肝内胆管癌组织中自噬调控蛋白Beclin1低表达的患者更容易发生淋巴结转移,预后较差。结论：胆管癌细胞水平的实验证明自噬可以被营养缺乏的环境所诱导,并且不论应用自噬抑制剂还是siRNA内源下调自噬通路激活水平,都可以影响胆管癌细胞的存活状态,进一步的实验证实抑制自噬可以引起细胞周期G2M期阻滞和加速细胞凋亡性死亡,这或许是自噬参与维持细胞存活的两条途径；体外成瘤实验也间接证实自噬是影响胆管癌肿瘤生长的因素之一；而结合人肝内胆管癌组织标本中检测到自噬通路处于较高水平活化状态,提示人肝内胆管癌特殊的低血供特点可能是诱发自噬的环境因素,自噬表达水平增高促进癌细胞的存活并为维持其恶性增殖提供能量。抑制自噬可以加速化疗药处理下胆管癌细胞的死亡,提示其可能协同化疗药物,提高细胞对化疗的耐受敏感性,具有潜在的临床辅助治疗应用前景。病理资料统计分析发现Beclin1表达相对较低的肝内胆管癌患者更容易发生淋巴结转移,并且预后相对较差。提示Beclin1除了调控自噬通路以外,还可能参与了转移通路的调控,其中的具体分子机制需要进一步研究探讨。