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丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)在工业生产上非常普遍,大多用作聚丙烯酰胺的生产原材。ACR对啮齿类动物的毒性主要表现在神经毒、生殖毒和致畸等作用,ACR职业中毒主要导致感觉-运动型周围及中枢神经(Central nervous system,CNS)病变。病理特征是神经元异常破坏、轴突尾部膨大、神经元微管(Microtubules,MT)数量减少。外源性ACR暴露使细胞内的Ca2+水平上升,之后使Calpain活化,导致细胞骨架(Cytoskeleton,CSK)组分之一的MT稳定性发生改变,使MT水解,最终导致CSK形态破坏,但其具体机制尚不明确。p35-CDK5/p25通路可以参与神经退行性病变、神经细胞迁移、突触生长和形成过程。假设ACR中毒过程中MT异常受损与Calpain激活有关,并存在p35-CDK5/p25通路参与,钙蛋白酶抑制剂Calpeptin(CP)对此存在干预作用。目的本研究通过建立雌性Wistar大鼠ACR神经中毒模型和CP干预模型,运用免疫荧光检测大小脑组织Calpain活性,蛋白免疫印迹技术测定α-tubulin、β-tubulin、CAM、CAMKⅡ、CDK5、p25和p35蛋白含量。研究CP干预ACR引起CNS的MT异常受损的作用和机制,为防治ACR引起CNS破坏提供潜在药物理论支持。方法1.动物处理和药剂配制 成年健康无特定病原体(SPF)雌性Wistar大鼠40只,大鼠初始体重范围在180～210 g之间。适应性喂养7 d后,依照每一组各有十只的数量,把四十只大鼠进行分配,随机分为Control组、CP组、ACR组和ACR+CP组4组,每组10只,记录此时为实验第0周。Control组腹腔注射(i.p.)注予大鼠生理盐水NS;CP 组注予大鼠 200 μg/kg b.w.CP(i.p.);ACR 组注予大鼠 30 mg/kg b.w.ACR(i.p.);ACR+CP 组在注予 30 mg/kg b.w.ACR(i.p.)大约一小时后,注予 200 μg/kg b.w.CP(i.p.)进行干预。ACR与CP给药(i.f.)容积均为1 ml/kgb.w.,每周三次,共持续四周。每周末称重一次,在终末染毒和干预处理后,大鼠以颈椎脱臼处死,大脑和小脑组织被短时间内剔取,即刻于-196℃的液氮中进行组织速冻,而后于-80℃冰箱冷置放存。2.步态评分 大鼠被人为放入透明有机玻璃盒(90 cm×90 cm)里观察3 min。根据步态分值规则,把分值划为1分～4分,其中步态正常没有受损为1分;步态轻度受损为2分;步态中度受损为3分;步态重度受损为4分。3.转棒试验 在200 s内逐渐从0 r/min加速到40 r/min,并把大鼠放在旋转杆上进行训练。大鼠停留于转棒上的停留时间作为被测数据进行登记,每只大鼠每次试验间隔时间为三十分钟,连续进行三次测量,计算平均停留时间。4.组织匀浆 取置于-80℃冰箱冷冻的大脑和小脑组织,分别称取0.5 g,切碎投至匀浆器中,于冰浴中充分匀浆;完成离心操作后,吸出组织上清液,并把其转入Eppendolf管进行标注,放入冰箱中速冻。5.Calpain活性测定 采用BCA蛋白浓度检测盒测定大脑和小脑组织匀浆中的蛋白含量和AMC钙蛋白酶活力。6.蛋白测定 取大脑和小脑组织匀浆,通过凝胶电泳和蛋白免疫印迹技术测定α-tubulin、β-tubulin、CAM、CAMKⅡ、CDK5、p25 和 p35 蛋白含量。7.统计分析 资料描述为(?),以单因素方差分析(One Way Analysis of Variance)比较分析体重增加量、转棒试验停留时间、Calpain活性和蛋白定量数据,辅以LSD或Dunnett分析,Mam-Whitney U检验以计算步态分值。以上资料全以SPSS24.0计算,检验水准α=0.05。结果1.体重变化在整个实验过程里,Control组和CP组大鼠体重增加量未显示异常,且与Control组比较,其他三组大鼠的处理第0周体重和第1周体重增加量均无异常(P＞0.05),基本处于相同水平。第2周以来体重增加量出现显著差异,且ACR组体重增加量显著低于Control组,ACR+CP组体重增加量相较于Control组无明显性变动,但显著高于ACR组(P＜0.05)。至第4周末,四组大鼠与各自处理第0周体重相比,平均体重分别增加58.69、54.57、36.20和50.13 g,ACR组体重增加量显著低于Control组(P＜0.05),ACR+CP组体重增加量相较于Control组无明显性变动,但显著高于ACR组（P＜0.05)。2.步态改变在整个实验过程里,Control组和CP组大鼠未显示受损步态,且相较于Control组,其他三组大鼠的处理第0周步态分值和第1周步态分值均无异常(P＞0.05);从第二周开始,ACR组大鼠呈现了步态略有受损的情况。至第4周末,相较于Control组,ACR组平均步态分值上升了 1.6分,ACR+CP组的平均分值上升了 0.8分;相较于ACR组,ACR+CP组的平均分值降低了 0.8分（P<0.05)。3.转棒试验在整个实验过程里,Control组和CP组大鼠转棒试验停留时间未显示异常变化,且相较于Control组,其他三组大鼠的处理第0周转棒试验停留时间和第1周停留时间均无异常(P＞0.05)。ACR组的停留时间从第三周开始缩短,且显著低于Control组,但ACR+CP组的停留时间长于ACR组(P<0.05)。至第四周末,相较于Control组,CP组的停留时间无明显性变动,但ACR组和ACR+CP组的停留时间显著下降;相较于ACR组,ACR+CP组停留时间增长(P<0.05)。4.Calpain相较于Control组,CP组大鼠的Calpain活性没有显著变化,ACR组大鼠的Calpain活性在大脑和小脑组织中均呈现显著上升趋势,分别上升了 59.86%和31.17%(P<0.05)。相较于ACR组,ACR+CP组Calpain活性则均呈明显下降趋势,分别下降 32.80%和 21.25(P<0.05)。5.MT蛋白相较于Contro1组,CP组大鼠的α-tubulin和β-tubulin含量没有显著变化,ACR组α-tubulin和β-tubulin的含量都显示出明显的上升趋势,在大脑组织中分别上升了12.63%和21.14%,在小脑组织中分别上升了 1 5.54%和33.35%(P<0.05)。相较于ACR组,ACR+CP组α-tubulin和β-tubulin的含量则呈现显著下降趋势,在大脑组织中分别降低了 13.10%和10.96%,在小脑组织中分别降低了 24.03%和19.41%(P<0.05)。6.CAM 和 CAMKⅡ相较于Contro1组,CP组大鼠的CAM和CAMKⅡ含量变化不显著,ACR组CAM和CAMKⅡ的含量均呈现显著上升趋势,在大脑组织中分别上升了 57.33%和46.00%,在小脑组织中分别上升了 42.18%和54.18%(P<0.05)。相较于ACR组,ACR+CP组CAM和CAMKⅡ的含量则呈现显著降低趋势,在大脑组织中分别降低了 18.88%和32.58%,在小脑组织中分别降低了 16.51%和18.51%(P<0.05)。7.CDK5,p35,p25大脑:相较于Contro1组,CP组大鼠CDK5和p35的含量呈上升趋势,分别上升31.01%和19.04%(P＜0.05),ACR组CDK5、p35和p25的含量均呈现显著上升趋势,分别上升了 52.81%、40.58%和 25.05%(P<0.05),ACR+CP 组大鼠 CDK5 和 p35 的含量呈现上升趋势,分别上升了 42.80%和22.60%(P<0.05)。相较于ACR组,ACR+CP组CDK5、p35和p25的含量则呈现显著降低趋势,分别降低了 6.55%、12.79%和25.65%(P<0.05)。小脑:相较于Contro1组,CP组大鼠CDK5和p25的含量呈现上升趋势,分别上升25.45%和44.44%(P<0.05),ACR组CDK5、p35和p25的含量均呈现显著上升趋势,分别上升了 47.11%,15.60%和 76.84%(P<0.05),ACR+CP 组大鼠 CDK5 和 p25 的含量呈现上升趋势,分别上升了 37.25%和31.37%(P<0.05)。相较于ACR组,ACR+CP组CDK5、p35和p25的含量则呈现显著降低趋势,分别降低了 6.70%,23.17%和24.43%(P<0.05)。结论1.CP存在干预ACR所致CNS的MT受损的作用。2.在ACR所致CNS的MT受损中,CP干预MT的动态平衡的机制可能是通过激活Calpain 调节 p35-CDK5/p25-tubulin 通路来完成。