生物催化剂与传统化学催化剂相比较,具有高度的专一性和高效的催化能力,被广泛应用于合成复杂药物中间体、精细化学品等。天然酶缺乏商业酶制剂应用所需的特性,而不断发展的定向进化技术结合高质量的诱变方法和高效的筛选方法,能够快速筛选出更优质的特性或新功能。定向进化是一种功能强大且广泛使用的酶工程方法。随着人们对蛋白质结构功能的深入探究,以及计算机程序和计算能力的不断提高,计算机辅助设计已经经常应用于酶工程改造。蛋白质结构功能取决于氨基酸残基之间的相互协同作用,以计算机辅助设计筛选氨基酸靶点为基础的现有的多点组合突变的定向进化诱变方法无法同时实现突变多样性和大量的克隆数,因此,需要研究开发一种新的定向进化的诱变方法对关键氨基酸位点进行组合突变。本研究开发设计了一种多点组合突变(Multi-points Combinatorial Mutagenesis,MCM)方法,该方法构建的质粒文库可以同时实现高度丰富的突变率和大量克隆数。首先利用DNA组装技术拼接突变目的基因;随后基因片段与载体片段经融合PCR得到两种不同位置有缺口的线性质粒片段;最后两种线性质粒体外杂交得到环状质粒分子,并转化至大肠杆菌感受态获得突变库,实现多点组合突变。通过优化融合PCR反应条件以及线性质粒杂交条件,最终电转至大肠杆菌感受态Escherichia coli TreliefTM5α所获得的单菌落数量(Colony-Forming Units,CFUs)超过 106 CFUs/μg DNA。应用优化后的MCM方法定向进化改造苯甲酰甲酸脱羧酶(Benzoylformate Decarboxylase,BFD)来测试该方法的效率。菌落PCR验证以及DNA测序结果表明:90/100个单菌落精确组装;5个位点同时组合突变的频率达到80%以上;NDT简并密码子衍生的12种可能氨基酸残基均包括在内。最后筛选到酶催化活性提高2倍的突变体(BFD-F3:L109Y,L110D,H281G,Q282V和A460M),动力学参数测定表明突变体BFD-F3的kcat提高约6倍,最终kcat/Km为1.35 M-1 s-1,约为野生型的10倍。气相色谱-质谱法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)检测结果表明 BFD 蛋白确实催化合成羟基乙醛。本研究课题成功构建了一种多点组合突变的定向进化诱变方法,该方法在指定的目的位点引入丰富的突变多样性,同时创建大量的克隆数覆盖突变的可能性。因此,若与计算机辅助设计方法结合,该方法可以显著提高酶工程效率,有望对定向进化技术发展产生显著的影响。