研究背景自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder,ASD)是一种复杂的异质性神经系统弥漫性发育障碍疾病,其核心症状为社会交往和交流障碍,重复刻板样行为以及限制或狭窄的兴趣与爱好。根据临床资料,在美国每59名儿童中就有一名ASD患儿,每年对ASD患者的治疗和护理的估计成本高达115-609亿美元,对ASD的干预已然成为非常紧迫的公共卫生需求。基于行为疗法的社交技能干预和针对合并症的药物治疗已被运用于阿斯伯格综合征和高功能自闭症患者,但由于该疾病病理发生机制的复杂性及现有研究模拟该疾病实验动物模型的局限性,目前尚未证实能够改善ASD核心症状的有效药物。根据现有研究,与ASD病理发生相关的主要脑区包括前额叶皮层、杏仁核、海马和下丘脑等。在哺乳动物(包括灵长类和人)的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中,海马齿状回(Dentate gyrus,DG)的颗粒下区(Subgranular zone,SGZ)和侧脑室室下区(Subventricular zone,SVZ)是生后及成年持续存在神经发生的区域。在海马DG的形态发生过程中,放射状胶质细胞(Radial glia cells,RGCs)对DG的发育有着至关重要的作用,其中初级RGCs决定胚胎期DG的发育,一方面作为干细胞产生神经前体细胞(Neural progenitor cells,NPCs),一方面RGC由胞体伸出的长突起跨越从海马伞到软膜表面的距离介导NPCs迁移。而次级RGCs由DG的初级RGCs转化而来,是DG后期结构形态发生过程中最重要的前体细胞。小鼠的次级RGCs的放射状支架在生后10天至14天左右完全发育,定位于海马DG的SGZ,决定生后及成年DG内干细胞池内NPCs的数量。在小鼠DG中绝大多数颗粒细胞是在生后第一周末的增殖高峰产生,因此,生后早期NPC库的大小可能是决定终生神经发生和海马功能的重要因素。大量的实验研究表明,海马SGZ产生的新生神经元能够整合入海马环路中,参与认知等脑的高级功能与情绪调节,而海马神经发生受损与成瘾、抑郁、精神分裂症和自闭症等精神疾病都紧密相关。已有证据表明,与神经发生受损相关的齿状回体积减少和自闭症患者的自闭样行为有关。在不同的自闭症动物模型中证实,旨在恢复受损的海马神经发生的治疗对改善自闭症相关行为均有一定的效果。因此,挽救受损的海马神经发生可作为一可能的干预策略改善自闭症样行为。不同于成年期急性给药导致的短期治疗效果,越来越多的证据表明生后早期治疗可以对自闭症症状的改善产生更加持久的作用。自闭症的病理发生是遗传与环境因素相互作用的结果,并导致胚胎期和生后早期的神经发育异常。临床上自闭症患儿的诊断最早可提前至生后6个月,使生后早期干预成为可能。人类大脑的快速生长期开始于妊娠晚期,持续至生后前两年,在出生前后达到高峰;对于小鼠,生后3-4周是大脑快速生长期,并在生后10天(Postnatal day 10,P10)左右达到高峰。在脆性X综合征(Fragile X Syndrome,FXS)和母体免疫激活的自闭症模型小鼠中证实生后早期干预可减轻自闭症样行为。我们前期研究亦发现,生后早期采用肝脏X受体(Liver X receptor,LXR)激动剂TO901317进行干预可改善特发性自闭症模型小鼠(BTBR T+tf/J,BTBR)和丙戊酸(Valproic acid,VPA)诱导的自闭症模型小鼠的社交缺陷和重复理毛行为,并观察到一定程度上恢复了两种模型小鼠中受损的海马神经发生。提示基于改善海马DG发育关键期海马神经发生的策略,能够持续改善自闭症样行为。二甲双胍是一种广泛用于治疗糖尿病的双胍类药物,亦可以用于调节多种神经精神疾病中受损的认知功能。已有证据表明,在阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)小鼠模型中,二甲双胍有助于促进其空间记忆修复,并且有效地挽救海马中的神经元死亡,从而促进AD小鼠海马神经发生。临床研究证实,二甲双胍可以显著改善FXS患者的社交缺陷。我们的前期研究结果显示,P7到P14采用二甲双胍干预能显著改善成年BTBR小鼠的社交缺陷和重复刻板行为。我们推测,二甲双胍修复BTBR小鼠的行为缺陷,可能与挽救受损的海马神经发生有关,而其作用途径仍需进一步阐明。由于二甲双胍是一种化学合成药物,其生后早期使用风险有待评估,而姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种天然多酚类物质,已被证明对神经疾病和精神障碍具有神经保护作用。在VPA诱导的自闭症大鼠模型中已被证实生后早期补充姜黄素没有神经毒性,并且可以挽救发育迟缓和体重异常。同样,在AD大鼠模型中证实,P28到P49的姜黄素治疗可显著改善其认知障碍的同时亦增强了海马神经发生。体外实验亦发现姜黄素在NPCs的增殖和分化中起着重要作用。姜黄素作为一种天然产物,具有广泛的生物学效应,在一定程度上能够符合自闭症异质性的治疗要求。姜黄素能否通过改善海马神经发生,进而减轻自闭症样行为,仍需要进一步探索。由于自闭症是遗传和环境多种因素共同作用导致的发育障碍疾病,相比于单一疗法,系统干预被认为更符合自闭症全面治疗的需求。研究发现,系统疗法具有更加持久的全面调节作用。已有研究报道,通过与年轻小鼠并联共生或者注射年轻小鼠血浆可以增强老年小鼠和AD小鼠海马神经发生和突触可塑性,逆转该小鼠的认知缺陷,表明系统干预对大脑功能有着重要的调节作用。因此,新生期野生小鼠血浆对自闭症模型小鼠海马神经发生和行为改善的作用值得进一步探索。研究方法:1.雄性C57BL/6J(C57)和BTBR小鼠在P7至P14腹腔注射二甲双胍(200mg/kg),对照组注射等体积的生理盐水,于P14收取脑组织样本。用免疫荧光的方法检测小鼠DG内NPCs增殖情况,以及NPCs和新生神经元的数量。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)和Ki67标记DG增殖的细胞,Sox2和胶原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)共同标记RGCs,Prox1标记海马DG颗粒神经元,用以明确新生期二甲双胍治疗对BTBR小鼠DG神经发生的改善效果。2.雄性C57和BTBR小鼠在P6至P8腹腔注射姜黄素(20mg/kg),对照组注射等体积的0.1%二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)。为了评估DG中的NPCs增殖情况,于P8给予单次BrdU腹腔注射后收取脑组织样本。采用BrdU和Sox2的免疫荧光标记DG中增殖的NPCs,Sox2和GFAP共同标记RGCs来衡量干细胞库的容量。为了评估细胞分化和成熟情况,于P8至P10每日注射1次BrdU,共计3次,于P24收取样本。微管相关蛋白(Doublecortin,DCX)和BrdU共同标记未成熟的新生神经元,NeuN和BrdU共同标记来检测神经元的成熟情况,明确新生期姜黄素治疗对小鼠DG神经发生的影响。采用行为学方法来检测小鼠的社交、重复刻板样行为以及认知能力,探索姜黄素对自闭症相关行为的改善效果。3.雄性BTBR小鼠从P7到P13腹腔注射野生小鼠血浆(5μl/g),对照组予以等量生理盐水,隔天1次,收取P14脑组织样本。采用BLBP/Nestin免疫荧光标记DG中RGCs,DCX标记未成熟神经元,并用免疫印迹实验(Western blot,WB)检测海马中DCX蛋白表达量,以观察新生期野生小鼠血浆对自闭症模型小鼠海马神经发生的作用。于成年期通过三箱社交、理毛和埋珠实验明确血浆治疗对BTBR小鼠社交缺陷和重复刻板行为的影响。研究结果:1.新生期二甲双胍治疗改善BTBR小鼠海马神经发生缺陷(1)与P14的C57小鼠相比,BTBR小鼠海马DG内BrdU标记的增殖细胞明显减少,二甲双胍治疗可显著增加BTBR小鼠DG内BrdU阳性细胞数;Ki67同样是增殖细胞相关核抗原,其统计结果亦表明于生后早期进行二甲双胍注射能够有效增加BTBR小鼠的海马DG内NPCs数量;(2)采用Sox2以及Sox2与GFAP双标分别标记DG内的NPCs和RGC,发现在P14时BTBR小鼠海马DG内NPCs和RGC数量相较于C57小鼠显著减少,二甲双胍干预后,BTBR小鼠海马DG内NPCs和RGC数量可显著扭转;(3)Prox1用以特异性标记海马DG颗粒神经元,在P14时BTBR小鼠海马颗粒细胞层(Granule cell layer,GCL)内Prox1阳性细胞数量与C57小鼠比较有显著的统计学差异,提示NPCs分化成颗粒细胞受到阻滞;新生期二甲双胍治疗可有效增加BTBR小鼠颗粒层Prox1标记的颗粒神经元数量。2.新生期姜黄素治疗改善BTBR小鼠自闭样行为及海马神经发生缺陷(1)三箱社交实验结果显示,BTBR小鼠表现出明显的社交缺陷。新生期姜黄素干预后,C57小鼠的社交表现没有显著变化,而BTBR小鼠探索陌生小鼠及其箱体的时间明显增多。在雄雌鼠交互实验中,姜黄素治疗对BTBR雄鼠与C57雌鼠间的嗅探时间并无明显改变,提示本实验中姜黄素治疗主要改善BTBR小鼠在三箱社交中的社交行为。(2)重复刻板样行为的相关检测显示,BTBR小鼠表现出高水平的重复刻板样行为,理毛时间和埋珠数量均明显多于C57小鼠,而新生期姜黄素治疗可减弱BTBR小鼠的理毛和埋珠行为,结果有统计学差异。(3)新物体识别实验结果显示,BTBR小鼠短期记忆缺损。BTBR小鼠对新物体的识别系数(Discrimination index,DI)显著低于C57小鼠,姜黄素干预可有效改善BTBR小鼠受损的认知能力,DI明显增大。(4)开场实验结果显示,BTBR小鼠的运动能力强于C57小鼠。新生期姜黄素干预后,C57小鼠和BTBR小鼠的运动能力和焦虑水平均没有显著变化。(5)BTBR小鼠自闭样行为与海马神经发生受损有关。P8时BTBR小鼠海马DG区BrdU标记的阳性细胞、Sox2标记的NPCs以及Sox2与GFAP双标记的RGC数量显著减少,姜黄素早期干预可显著增强BTBR小鼠海马NPC增殖,并维持海马DG内干细胞库的容量。(6)BTBR小鼠海马的NPC分化成熟受到抑制。于P8-P10进行BrdU注射后,在P24时BTBR小鼠GCL(包括SGZ)BrdU阳性细胞、DCX与BrdU标记的未成熟新生神经元以及NeuN与BrdU标记的成熟神经元数量显著减少。而生后早期姜黄素处理后的BTBR小鼠上述细胞数量显著增多。结果提示,生后早期姜黄素治疗可显著改善BTBR小鼠NPC的分化与成熟。3.新生期野生小鼠血浆注射改善BTBR小鼠自闭症样行为及海马神经发生缺陷(1)在三箱社交实验中,新生期经C57小鼠血浆治疗后,BTBR小鼠社交缺陷得到显著改善。(2)在理毛和埋珠实验中,新生期经C57小鼠血浆治疗减弱了BTBR小鼠的高频理毛和埋珠行为。(3)P14时,BTBR小鼠海马DG区BLBP和Nestin双标记的RGCs和DCX标记的未成熟神经元较C57小鼠显著减少,免疫印迹实验(Western blot,WB)检测到BTBR小鼠海马中DCX蛋白表达也明显低于C57小鼠;新生期C57小鼠血浆治疗可显著增加BTBR小鼠海马DG区上述两种细胞数量和海马内DCX的蛋白表达。研究结论:上述结果表明:生后早期是自闭症干预的关键时期,采用二甲双胍、姜黄素两种药物以及C57小鼠血浆注射进行关键期干预均可显著改善BTBR小鼠DG区干细胞库的容量,促进海马神经发生;进而可以改善BTBR小鼠社交缺陷、重复刻板样行为以及认知能力。