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卵泡生长发育及闭锁退化是一个复杂而又高度协调的生理过程,不仅受下丘脑-垂体-性腺轴(HPG axis)的调控,也受卵泡内旁分泌/自分泌因子等的共同调节。为进一步揭示牛卵泡发育的分子机制,筛查调控卵泡发育关键基因,本研究以牛卵巢为材料,采用高通量IlluminaHiSeq测序平台对四组不同级别卵泡(直径<2mm,2-5mm,5-8mm,>8mm)进行转录组测序,将质控过的数据比对到参考基因组,筛选出差异表达基因并进行趋势分析。对趋势基因进行GO分类和KEGG注释,找到趋势基因的生物学功能富集和特异性代谢通路。分析牛卵泡基因表达过程中存在的可变剪接现象及出现的新转录本。对部分差异表达基因开展实时定量PCR验证,在此基础上进一步选取SIRT1和INHBA基因进行功能研究。本研究主要研究内容和结果如下:1.测序数据统计与分析四组样本测序过滤后Quality scores大于20,mapping准确度大于99%,可用于后续分析;四组样本(按照卵泡直径由小到大,分别以BF1-4表示)能够比对到参考序列上的对比率分别为90.0%、89.0%、90.0%和92.5%。2.差异表达基因筛选将不同样本组两两比对,筛选各组间差异表达基因进行趋势分析。其中,BF1-VS-BF2比对筛出1576个差异表达基因,其中861个上调,714个下调;BF1-VS-BF3组筛出1451个差异表达基因,其中499个上调,952个下调;BF1-VS-BF4组筛出2359个差异表达基因,其中1059个上调,1300个下调;BF2-VS-BF3组筛出1447个差异表达基因,其中479个上调,968个下调;BF2-VS-BF4组筛出1122个差异表达基因,其中445个上调,677个下调;BF3-VS-BF4组筛出2403个差异表达基因,其中1310个上调,1093个下调。3.差异表达基因趋势及功能富集分析以显著性差异基因的并集为研究对象进行趋势分析,获得了8个显著变化的趋势模型(P<0.05)。将表达上调趋势的基因和下调趋势的基因分别合并,进行GO分类和KEGG通路分析。全部上调趋势的基因中,有538个被注释到生物过程类481条GO term中,523个注释到分子功能类的121条GO term中,556个注释到细胞组分类的54条GO term中;全部下调趋势的基因中,有415个被注释到生物过程类的276条GO term中,402个注释到分子功能类的102条GO term中,432个注释到细胞组分类的352条GO term中。通过KEGG通路分析,217个上调差异表达基因被显著富集到38条KEGG Pathway中,190个下调差异表达基因被显著富集到19条KEGG Pathway中。4.可变剪接及新转录本预测对各组可变剪接事件和新转录本分别进行统计,在BF1-BF4样本组各9293、15150、15925、12821个基因中,分别发现15709、27415、29449、21900个可变剪接事件;鉴定出新转录本各1823、1889、1648、1794个。通过CPC软件对新转录本的编码进行预测,结果BF1-BF4样本组各有534、723、645、655个新转录本编码新的蛋白,分别占新转录本总数的29.29%、38.27%、39.14%和36.51%。5.SIRT1基因对牛卵泡颗粒细胞的增殖、凋亡的作用及机制研究利用免疫组化法检测发现,SIRT1蛋白分子在颗粒层细胞中表达,膜层细胞仅有少量表达。用SIRT1-bos-1597、SIRT1-bos-1471、SIRT1-bos-1186和SIRT1-bos-1306干扰载体转染颗粒细胞,48 h后实时荧光定量PCR法检测各组SIRT1基因的相对表达量,筛选出抑制效果最好的载体SIRT1-bos-1471,转染颗粒细胞,干扰SIRT1基因表达。转染后24、36、48和60 h检测颗粒细胞增殖、细胞周期、凋亡和凋亡相关基因表达情况。结果表明:与空白组和阴性对照组相比,干扰组颗粒细胞显著增殖(P<0.05);G1期细胞比例显著减少(P<0.05),S期细胞比例增多(P<0.05);凋亡相关因子Bax mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05);雌激素和孕酮分泌显著减少(P<0.05)。结果表明SIRT1在颗粒细胞增殖及凋亡过程中发挥重要作用,推测SIRT1通过调节细胞周期抑制颗粒细胞增殖,通过调节Bcl-2家族基因表达促进颗粒细胞凋亡。6.INHBA基因对牛卵泡颗粒细胞的增殖、凋亡的作用及机制研究利用免疫组化法检测发现,牛INHBA蛋白分子主要在颗粒层细胞中表达,膜层细胞仅有极少量表达。用INHBA-bos-1365,INHBA-bos-682,INHBA-bos-603和INHBA-bos-532干扰载体转染颗粒细胞,48 h后实时荧光定量PCR法检测各组INHBA基因的相对表达量,筛选出抑制效果最好的载体INHBA-bos-682转染颗粒细胞,干扰INHBA基因表达。转染后24、36、48和60 h检测颗粒细胞增殖、细胞周期、凋亡和凋亡相关基因表达情况。结果表明:与空白组和阴性对照组相比,干扰组颗粒细胞显著减少(P<0.05);G1期细胞比例显著增加(P<0.05);干扰后60 h S期细胞比例显著减少(P<0.05),其余时间点S期细胞比例均无显著差异(P>0.05);颗粒细胞凋亡增加(P<0.05),Bax mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05);雌激素和孕酮分泌显著减少(P<0.05)。结果表明,INHBA在颗粒细胞增殖及凋亡过程中发挥重要作用。推测INHBA通过调节细胞周期来促进颗粒细胞增殖,通过Bcl-2途径抑制颗粒细胞凋亡。综上所述,本研究通过对牛不同直径卵泡进行转录组分析,初步筛选出影响卵泡发育的候选基因,并对其中的SIRT1基因和INHBA基因在卵泡颗粒细胞的作用及机制进行初步研究,研究结果为深入挖掘控制卵泡发育的关键基因及分子机制奠定基础。