第一部分 不同浓度的AI-2对铜绿假单胞菌生物膜形成及毒力因子产生的影响　　目的：铜绿假单胞菌（P. aeruginosa; PA）作为院内感染的最常见病原体之一 ;其致病性主要在于其生物被膜（Biofilm; BF）的形成和分泌的毒力因子;本课题组前期调查中发现呼吸机相关性肺炎（Ventilator-associated pneumonia; VAP）患儿导管上产自诱导因子 2 （Autoinducer-2; AI-2）细菌如链球菌属和克雷伯杆菌属与铜绿假单胞菌广泛共存;这种有趣的现象引起了我们的注意。本研究目的在于探讨AI-2是否能作为中间桥梁影响PA野生菌株PAO1 BF的形成和毒力因子的产生。　　方法: 将实验分为6组;分别为空白对照组、0.1nM AI-2组、1nM AI-2组、10nM AI-2组、100nM AI-2组、1μM AI-2组。结晶紫法、平板计数法以及激光共聚焦显微镜（CLSM）观察BF形成。氯仿萃取法、刚果红化学法分别测定不同组产生绿脓菌素和弹性蛋白酶的量或者活性。　　结果: 外源性加入0.1nM; 1nM和10 nM AI-2 能够显著增加PAO1的生物膜形成、BF 内活菌数和毒力因子的产生(P<0.05);然而在高浓度AI-2 (100 nM and 1μM)作用下;细菌生物膜量、BF内活菌数和毒力因子与对照组相比无明显差异。另一方面; AI-2对铜绿假单胞菌PAO1浮游细菌的生长没有明显影响。　　结论: AI-2能促进PAO1 BF的形成、毒力因子的产生;且呈现为一个浓度梯度的作用（抛物线型）;在浓度为10nM时达顶峰。提示我们 VAP 患儿导管上细菌间可能依赖于 AI-2 作为沟通的桥梁;那么以AI-2作为作用靶点将成为新生儿VAP（包括其他的导管相关感染）的防治提供了新的思路。　　第二部分AI-2对铜绿假单胞菌肺炎小鼠致病性的影响　　目的：我们在第一部分已经证实AI-2可以促进体外PA BF形成;毒力因子的产生;那么这种作用是否同样存在于体内呢？毕竟大部分体外实验结果很难在体内完全重复。因此;AI-2是否能增强小鼠PA感染后肺炎的严重性;这将是本部分讨论的重点。　　方法: 将实验分为4组;分别为PBS组、单独AI-2组、单独PAO1组和 AI-2+PAO1 组。分别观察小鼠生存率情况、计数肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid; BALF）中细胞总数;平板计数肺组织内活菌数;H＆E 染色观察肺部病理损伤;ELISA法检测BALF中TNF-α 、IL-6、IL-10等细胞因子数量。　　结果: 与单独 PAO1 感染组相比较;AI-2+PAO1 组小鼠死亡率、肺组织内活菌数、BALF中细胞总数以及促炎因子TNF-α 、IL-6数量显著升高 (P<0.05);肺组织炎症细胞浸润更加明显。AI-2+PAO1 组与单独PAO1组在IL-10水平无显著差异(P>0.05)。　　结论：AI-2可促进PA肺炎小鼠感染的致病性;可能主要与 AI-2增加了PA的侵袭性以及炎症介质的释放有关。　　第三部分AI-2对铜绿假单胞菌的调控机制　　目的：PA的密度感应 (Quorum sensing; QS) 系统是BF形成和毒力因子产生的关键因素;控制着超过 10%的基因表达。前两部分已证实AI-2能增强PAO1 BF的形成以及致病性;但具体机制不明。那么; AI-2对PA上述的促进作用是否与其QS系统作用有关呢？　　方法： qPCR法检测AI-2对PAO1的QS基因（包括lasI、lasR、rhlI、rhlR）和毒力基因（包括 lasA、lasB、phzH、rhlA）表达。敲除PAO1 QS基因LasR和rhlR并将实验分为4组;分别为单独PAO1组、AI-2+PAO1 组、单独 PAO1 QS 基因敲除组（P.a ΔLasRΔrhlR 组）、AI-2+PAO1 QS基因敲除组P.aΔLasRΔrhlR组（AI-2+ P.aΔLasRΔrhlR组）。结晶紫、激光共聚焦显微镜（CLSM）观察 BF 形成;氯仿萃取法、刚果红法分别测定不同组产生绿脓菌素和弹性蛋白酶的量或者活性。　　结果：在浓度为10nM AI-2的作用下;PAO1 QS基因（包括lasI、lasR、rhlI、rhlR）和毒力基因（包括lasA、lasB、phzH、rhlA）表达量明显高于单独PAO1组(P<0.05);敲除PAO1 QS基因后;其生物膜形成、毒力因子的产生都明显低于野生株 PAO1(P<0.05)。而 P.aΔLasRΔrhlR与AI-2+P.a ΔLasRΔrhlR两组相比;其生物膜形成和毒力因子的产生无明显差异(P>0.05)。　　结论：AI-2通过上调PAO1 QS基因的表达促进其BF形成、毒力因子的产生。