糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的并发症之一,其主要的病理特征为肾小球硬化及肾小管间质纤维化。DN的发病机制非常复杂,高血糖被认为是DN形成过程中的主要始动因子。在高血糖的长期刺激下,活性氧（reactive oxygen species,ROS）大量生成,从不同环节促进DN的病理进程。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是体内重要的致纤维化生长因子,在TGF-β1作用下,PI3K激活,并可以促进下游主要作用靶点Akt的磷酸化激活。Akt的磷酸化激活促使FoxO3a磷酸化失活,进而使MnSOD的表达减少,从而降低了氧自由基的清除功能,引起氧化应激损伤。虽然大量研究已经证实高糖引起细胞内ROS产生增多是糖尿病并发症的共同基础,然而在DN时,高糖诱导的ROS的大量产生与TGF-β1/PI3K/Akt信号通路以及其下游的FoxO3a和MnSOD之间的关系尚未完全阐明。近来的研究表明,肾小管上皮细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肾间质纤维化的重要发病机理。研究发现,过量的ROS对EMT的发生发展具有促进作用,且TGF-β1作为体内最重要的致纤维化因子,可通过Smads途径及非Smads途径,促进肾小管EMT。而在非Smads途径中PI3K/Akt通路的作用愈发重要。然而PI3K/Akt通路的激活是如何促进EMT过程的,其具体机制尚未阐明。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是PI3K/Akt通路下游的重要效应蛋白,对细胞生长、增殖和分化具有关键的调控作用。然而mTOR信号分子是否参与了EMT的过程,国内外尚未见相关报道。如果mTOR是TGF-β1/PI3K/Akt信号通路促进EMT的重要的中间环节,那么以mTOR分子作为靶蛋白,抑制mTOR的表达及活性进而阻抑肾间质纤维化,是开发DN防治药物的可行性较强的新思路。银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract,EGb）是采用现代提取技术从银杏叶中提取的活性成分,其有效成分包括黄酮苷类和萜类。大量研究证实EGb具有抗氧化、扩血管、降血脂、改善血流动力学状态等广泛的药理作用。研究发现EGb能够抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT,EGb抑制EMT的作用是否与TGF-β1/PI3K/Akt信号通路以及mTOR直接相关?目前尚未见文献报道。因此,本研究在细胞水平和整体动物水平,对TGF-β1/PI3K/Akt信号通路在DN中的作用及其机制进行研究,并探讨EGb对TGF-β1/PI3K/Akt通路的作用,为从中药中筛选DN防治药物提供理论和实验依据。第一部分高糖环境下TGF-β1/PI3K/Akt信号通路对大鼠肾小球系膜细胞中氧化应激的调控作用目的:探讨高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cell,MC）中TGF-β1/PI3K/Akt信号通路对活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生的调控作用。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cell,MC）,将其分为正常组（NS组）、甘露醇组（MA组）、高糖组（HG组）、溶媒对照组（DMSO组）、过氧化氢组（H₂O₂组）、TGF-β1抑制剂组（SB431542组）、PI3K抑制剂组（LY294002组）以及抗氧化剂组（NAC组）。各组细胞培养24 h后,流式细胞仪检测细胞中ROS的水平;RT-PCR法测定TGF-β1 mRNA、MnSOD mRNA的相对含量;ELISA法测定TGF-β1的分泌水平;Western blot法测定细胞中Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达水平;免疫荧光法观察FoxO3a的细胞内分布。结果:与NS组相比,HG组ROS释放量显著增加,TGF-β1 mRNA及蛋白分泌水平明显提高,p-Akt和p-FoxO3a的蛋白表达增加,MnSOD的表达降低,FoxO3a从细胞核内移出滞留在细胞浆中;与HG组比较,TGF-β1抑制剂组、PI3K抑制剂组及抗氧化剂NAC组Akt和FoxO3a的磷酸化水平降低,MnSOD的表达增加,FoxO3a分布到胞浆中的量明显减少,主要定位在核内,使ROS的生成减少。结论:高糖状态下,大鼠肾小球系膜细胞中ROS生成增多,可以通过上调TGF-β1,激活其下游PI3K/Akt/FoxO3a信号通路,降低抗氧化酶MnSOD的表达,减弱了ROS的清除能力。第二部分糖尿病状态下TGF-β1/PI3K/Akt信号通路对db/db小鼠肾脏氧化应激的调控作用目的:在糖尿病肾病模型db/db小鼠上验证TGF-β1/PI3K/Akt信号通路对ROS产生的调控作用。方法:将db/db小鼠随机分成3组,DN模型组（DN组,8%DMSO）、TGF-β1抑制剂SB431542组(SB组,6.3μg·g^-1+8%DMSO)及PI3K抑制剂LY294002组(LY组,3.0μg·g^-1+8%DMSO),以db/m小鼠作为正常对照,每组8只。连续给药7 d后,葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖;化学比色法测定血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）和肌酐（creatinine,Cr）;ELISA法测定小鼠尿微量白蛋白;Western blot法测定肾皮质中Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达水平;免疫荧光法观察p-FoxO3a的荧光强度及分布,高效液相色谱法测定db/db小鼠血液及肾皮质中丙二醛的含量。结果:与正常db/m组小鼠相比,db/db小鼠的空腹血糖、肾脏指数、肌酐、尿素氮及尿微量白蛋白均显著增高（P<0.01）,肾皮质中Akt及FoxO3a的蛋白磷酸化水平明显升高（P<0.01）,p-FoxO3a的荧光强度显著增加,MnSOD的蛋白表达显著降低,血浆及肾皮质中丙二醛的含量均明显升高;与db/db小鼠相比,SB431542治疗组和LY294002治疗组的肌酐和尿素氮明显下降,肾皮质中Akt及FoxO3a的蛋白磷酸化水平明显降低,p-FoxO3a的荧光强度有了一定程度的减弱,MnSOD的表达明显增加,且血浆及肾皮质中丙二醛的含量均明显下降。结论:糖尿病肾病状态下,db/db小鼠肾皮质中TGF-β1/PI3K/Akt/FoxO3a信号通路激活,导致抗氧化酶MnSOD的表达下降,脂质过氧化产物MDA增多,加重氧化应激损伤。第三部分高糖环境下TGF-β1/PI3K/Akt信号通路对大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用目的:研究大鼠肾小管上皮细胞中高糖诱导的ROS对TGF-β1/PI3K/Akt信号通路的激活作用,以及其对肾小管上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:体外培养大鼠肾小管上皮细胞（normal rat kidney tubular epithelial cell line,NRK-52E）,将培养的细胞分为正常组（NG组）、高糖组（HG组）、过氧化氢组（H₂O₂组）、转化生长因子-β1组（TGF-β1组）,抗氧化剂组（NAC组）、TGF-β1抑制剂组（SB-431542组）、PI3K抑制剂组（LY-294002组）、mTOR抑制剂组（Rapamycin组）。分别在培养48 h时检测以下各项指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞中ROS的水平;ELISA法检测细胞TGF-β1分泌量;Western blot法测定细胞中Akt,p-Akt（Ser473）,mTOR,p-mTOR（Ser2448）,E-cadherin,α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）表达水平;Real time RT-PCR法测定TGF-β1 mRNA、E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA的相对含量。结果:与NG组比较,HG组细胞形态由铺路石样转变为梭形纤维样,ROS的释放量显著增加,TGF-β1 mRNA及蛋白分泌水平显著提高,p-Akt和p-mTOR蛋白表达显著升高,E-cadherin表达降低,α-SMA表达升高。与HG组相比,NAC组、LY294002组、SB431542组、Rapamycin组细胞形态较规则,呈铺路石样;NAC组ROS的生成量明显减少,TGF-β1 mRNA及分泌量明显下降;NAC组、LY294002组、SB431542组p-Akt和p-mTOR表达降低,Rapamycin组仅p-mTOR降低;NAC组、LY294002组、SB431542组、Rapamycin组E-cadherin mRNA水平其蛋白表达均升高,而α-SMA mRNA水平及其蛋白表达均降低。结论:高糖状态下,大量生成的ROS可通过上调TGF-β1表达,激活其下游PI3K/Akt信号通路,进而促进mTOR的磷酸化;mTOR的激活可促进肾小管EMT,进一步加剧肾间质纤维化。第四部分银杏叶提取物通过TGF-β1/PI3K/Akt/m TOR信号通路对大鼠肾小管上皮细胞转分化的抑制作用目的:观察银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba,EGb）对TGF-β1/PI3K/Akt信号通路的抑制及对其下游靶蛋白mTOR的调控作用,阐明EGb防治肾小管EMT的作用机制。方法:体外培养大鼠NRK-52E细胞,将培养的细胞分为正常组（NG组）、高糖组（HG组）、EGb低剂量组(GL组,10μg·ml^-1 EGb),EGb中剂量组(GM组,20μg·ml^-1 EGb),EGb高剂量组(GH组,40μg·ml^-1 EGb),mTOR抑制剂组（RAP组）。分别在培养48 h时检测以下各项指标:流式细胞仪检测细胞中ROS的水平;ELISA法检测细胞TGF-β1分泌量;Western blot法测定细胞中Akt,p-Akt（Ser473）,mTOR,p-mTOR（Ser2448）,E-cadherin,α-SMA表达水平;Real time RT-PCR法测定TGF-β1 mRNA、E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA的相对含量。结果:中、高剂量EGb可降低ROS的生成量,减少TGF-β1 mRNA及分泌水平,降低p-Akt和p-mTOR的蛋白表达,增加E-cadherin mRNA水平及蛋白表达,降低α-SMA mRNA水平及蛋白表达;而RAP仅降低p-mTOR蛋白表达,增加E-cadherin mRNA水平及蛋白表达,降低α-SMA mRNA水平及蛋白表达,对ROS的生成、TGF-β1的分泌和p-Akt无显著影响。结论:高糖培养的大鼠NRK-52E细胞中,EGb可通过减少ROS的大量生成,抑制TGF-β1/PI3K/Akt信号通路的激活,降低mTOR磷酸化,增加EMT的标志蛋白E-cadherin的表达,降低α-SMA表达,从而阻抑了高糖诱导的肾小管EMT。