卵巢癌是一个致命性的妇科恶性肿瘤。在美国2009年，在美国大约有21，880卵巢癌的新增病例，其中13，850人死亡。据统计，大约三分之二的患者已经到了癌症晚期，按照国际妇产科联合会(FIGO)分类相当于肿瘤的Ⅲ期或Ⅳ期。迄今为止，研究表明卵巢肿瘤的发生和发展与多基因的改变和调节异常以及多种信号传导通路相关。另外，诱导肿瘤增长及相关机制并不十分清楚。我们研究的重点是NDRG1基因，也叫做Drg-1、Cap43、RTP、Rit42 and PROXY-1，属于NDRG基因家族，这个家族由四个基因组成。该家族的其它成员NDRG2、NDRG3、NDRG4与NDRG1是同源性基因，大约有57％～65％相似性。NDRG1，是由394个氨基酸组成的43kD的蛋白，普遍存在于多细胞生物的正常细胞和肿瘤细胞的细胞质中。　　曾有研究表明，NDRG1在肿瘤的发生发展过程中起着很重要的作用，特别是侵袭和转移。相关研究对于该基因在肿瘤生长和转移中的作用产生了争论。多数研究认为，在肿瘤的发展和转移中NDRG1的作用是肿瘤抑制剂，例如:乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌、高转移结肠癌和胃癌。然而，一些学者认为，NDRG1可能是一个促肿瘤生长基因，比如肝细胞肝癌。总而言之，NDRG1与肿瘤发生发展相关。但它在卵巢癌中是促进肿瘤生长或是抑制肿瘤生长呢？我们当前的研究针对四种卵巢癌细胞株mRNA和蛋白的表达检测，并且分析它们表达含量异常的可能机制。充分揭示NDRG1在卵巢癌中的作用是必要的，从而我们可以推测出将NDRG1作为卵巢癌治疗靶点的展望和可行性。　　我们利用短发夹RNA介导的基因沉默技术来研究在卵巢癌OVCAR3细胞中下调NDRG1，并且观察细胞的形态学变化，细胞增殖，克隆集落形成实验，侵袭和迁移。并且观察抑制NDRG1后裸鼠异种移植模型的肿瘤生长的变化。另外，构建哺乳动物NDRG1表达载体pcDNA3.1(+)/NDRG1，并将其转染到卵巢癌OVCAR3细胞中，研究上调NDRG1对于细胞增殖和黏附，细胞凋亡和细胞周期的影响。　　第一部分、人卵巢癌不同细胞株中NDRG1表达以及短发夹状RNA质粒载体(NDRG1-shRNA)和重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)/NDRG1)的构建　　目的:检测四株不同人卵巢癌细胞株OVCAR3、HO8910、SKOV3和A2780中NDRG1表达;应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术设计构建NDRG1的短发夹状RNA(short hairpin RNA，shRNA)质粒载体并转染到OVCAR3细胞中，为后续研究奠定基础;构建pcDNA3.1(+)/NDRG1真核表达载体并转染到OVCAR3细胞，为在卵巢癌细胞株中上调NDRG1研究细胞的生物学特性作准备。　　方法:采用免疫印迹法、Real time RT PCR检测人卵巢癌细胞株中NDRG1蛋白和mRNA的表达;设计并化学合成三对高效的靶向NDRG1基因的重组质粒和阴性对照，通过双酶切实验和DNA测序法对重组质粒进行鉴定，将经测序验证正确的重组质粒，通过Lipofectamine2000共转染到转化入E.coli DH5a细胞，经筛选后，摇菌扩增质粒，用酶切消化、凝胶电泳及测序等方法，利用短发夹shRNA表达载体法转染OVCAR3细胞，建立稳定转染的细胞株OVCAR3-shNDRG1，采用Western blot法和Real time PCR法分别检测未转染组、阴性对照组及转染组细胞中NDRG1蛋白和mRNA表达量的变化，筛选出稳定低表达NDRG1的细胞株;提纯pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/NDRG1，并用DNA的限制性内切酶EeoRⅠ和XhoⅠ消化上述质粒，通过凝胶回收NDRG1 cDNA，用T4DNA连接酶将经酶切消化的线性pcDNA3.1(+)与回收的NDRG1 cDNA片段相连接，以构建成pcDNA3.1(+)/NDRG1真核表达载体，将pcDNA3.1(+)/NDRG1转化入E.coli DH5a，经筛选后，摇菌扩增pcDNA3.1(+)/NDRG1，用酶切消化、凝胶电泳及测序等方法，鉴定是否成功构建pcDNA3.1(+)/NDRG1，采用Lipofectamine2000将构建好的哺乳动物NDRG1表达质粒载体pcDNA3.1(+)/NDRG1转染入卵巢癌OVCAR3细胞中。　　结果:在四株不同转移能力的人卵巢癌细胞株中的检测结果表明，OVCAR3细胞株中NDRG1 mRNA的表达水平是SKOV3细胞株的1.86倍(P＜0.05);成功设计并合成三条的NDRG1特异性shRNA，经过双酶切实验和DNA测序报告显示，基因重组技术成功构建了NRDG1基因 RNA干扰质粒载体shRNA1-NDRG1、shRNA2-NDRG1、shRNA3-NDRG1和阴性对照载体shRNA-NC，成功转染OVCAR3细胞，通过Western blot法与Real time PCR法检测、验证和筛选，获得NDRG1基因抑制效果显著的稳定转染细胞株OVCAR3-shNDRG1;pcDNA3.1(+)/NDRG1经EeoRⅠ和XhoⅠ酶切消化及凝胶电泳后，结果显示酶切片段符合目的片段，质粒测序pcDNA3.1(+)/NDRG1的序列正确，符合目的NDRG1 cDNA序列，转染到 OVCAR3细胞中获得稳定的转染细胞株OVCAR3-pcDNA3.1(+)/NDRG1。　　结论:NDRG1基因在不同卵巢癌细胞中的表达水平均较低，在OVCAR3和HO8910细胞中的表达明显高于SKOV3和A2780细胞;成功靶向构建了NDRG1基因的特异性重组质粒，利用质粒载体成功筛选获得了NRDG1基因抑制效果显著的卵巢癌稳定转染细胞株OVCAR3-shNDRG1，为进一步研究NDRG1恶性生物学行为及其分子机制奠定实验基础;pcDNA3.1(+)/NDRG1构建成功并获得稳定的转染细胞株OVCAR3-pcDNA3.1(+)/NDRG1，为基因NDRG1转染到卵巢癌细胞后研究其生物学特性的改变奠定了基础。　　第二部分、短发夹RNA介导的NDRG1基因沉默对卵巢癌细胞恶性行为的影响　　目的:探讨低表达NDRG1对OVCAR3细胞增殖、侵袭和转移潜能的体内、外影响。　　方法:采用光学显微镜观察NDRG1基因沉默前后OVCAR3细胞的形态学改变;软琼脂克隆形成实验观察NDRG1基因沉默前后OVCAR3细胞的群体依赖性和增殖能力变化;Transwell小室侵袭实验和划痕实验检测下调NDRG1基因前后OVCAR3细胞的迁移和侵袭能力变化;MTT比色法测定NDRG1基因下调前后OVCAR3细胞的增殖能力改变;裸鼠皮下移植瘤实验观察NDRG1基因下调前后OVCAR3细胞的成瘤能力变化，观察低表达NDRG1后对裸鼠移植瘤的生长的影响。　　结果:体外实验发现，下调NDRG1表达未能使细胞形态发生变化:光学显微镜观察到，干扰组OVCAR3-shNDRG1与阴性对照组和正常对照组相比，细胞形态学没有发生明显变化;软琼脂克隆形成实验显示，干扰组OVCAR3-shNDRG1与阴性对照组和正常对照组相比细胞细胞生长速度加快，克隆形成数目显著增多(P＜0.05);Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示，与阴性对照组和正常对照组相比，干扰组OVCAR3-shNDRG1细胞穿过聚碳酸脂膜的迁移细胞数显著增加(P＜0.05);MTT法检测OVCAR3细胞的增殖结果显示，在转染后24h、48h、72h、96h，干扰组OVCAR3-shNDRG1与阴性对照组和正常对照组相比细胞生长速度明显加快(P＜0.05);在裸鼠移植瘤实验中发现，与阴性对照组相比，干扰组OVCAR3-shNDRG1移植瘤成瘤能力显著增强，瘤体体积增大，生长速度加快，侵袭性明显增加。　　结论:NDRG1基因沉默后没有发现卵巢癌OVCAR3细胞的形态变化，但却显著增加了OVCAR3细胞的增殖能力和侵袭转移能力，反向证实了NDRG1在卵巢癌OVCAR3细胞中增殖和侵袭转移恶性行为中的作用，具有作为卵巢癌预防、治疗基因靶点的潜在价值。　　第三部分、过表达NDRG1对OVCAR3细胞增殖、侵袭和转移能力影响的分子机制初步研究　　目的:初步探讨过表达NDRG1影响卵巢癌OVCAR3细胞侵袭和转移作用的分子机制。　　方法:将转染前后的 OVCAR3细胞分为实验组(OVCAR3-pcDNA3.1(+)/NDRG1组）、阴性对照组(OVCAR3-巧玲珑pcDNA3.1(+)组）、空白对照组（未转染组），研究在卵巢癌OVCAR3细胞株中上调NDRG1后在细胞增殖和黏附，采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，以及转染后对OVCAR3细胞中p53基因和p21基因表达的影响。　　结果:实验结果显示，与未转染组和转染空载组OVCAR3-pcDNA3.1(+)相比，OVCAR3-pcDNA3.1(+)/NDRG1组细胞可以很大程度抑制细胞增殖和黏附，促进细胞凋亡，并且在细胞周期中G0/G1期的细胞比例明显增加，同时，p53基因和p21基因表达也显著增加。　　结论:pcDNA3.1(+)/NDRG1载体在体外可显著的抑制卵巢癌OVCAR3细胞生长，并且可以有效的促进卵巢癌OVCAR3细胞的凋亡，为在体内研究抑制卵巢癌细胞增殖奠定了基础。NDRG1抑制卵巢癌细胞侵袭、转移能力可能是通过提高p53基因和p21基因在mRNA水平的表达和蛋白水平的表达而实现的。