目的:缺血/缺氧性脑损伤是脑血管病的主要致病机制之一，也是其高死亡率和高致残率的重要原因。而脑（血管）内皮细胞（CECs）是缺血/缺氧性损害的重要靶器官之一，缺血后的脑血管内皮细胞损伤会加速血脑障碍（BBB）的破坏，引起脑血管通透性增高和血管源性脑水肿，并最终加剧脑损害。研究缺血/缺氧后脑血管内皮细胞的损伤机制并寻找出行之有效的减轻损害的方法，对于缺血/缺氧性脑病的预防及治疗有重要的意义。在培养的鼠CECs中进行氧和葡萄糖剥夺（OGD）是研究缺血/缺氧性脑内皮细胞死亡机制的理想离体模型。本实验室先前采用MTT、LDH释放、ELISA、TUNEL染色及DNA梯度电泳等方法已证明OGD后CECs会出现细胞死亡，并且这种细胞死亡具有凋亡的某些特征，而caspase抑制剂zVAD-fmk可显著提高OGD后鼠CECs的存活率25%至75%，提示caspases在OGD诱导的鼠CECs凋亡中起重要的促进作用。本实验拟通过观察OGD后CECs细胞死亡过程中caspase-3和caspase-8的激活、细胞色<WP=63>素c从线粒体中释放、Bid的截短和激活、PARP的裂解的特征，并以广谱caspase抑制剂zVAD-fmk抑制caspases活性来探讨caspase-8和caspase-3激活、细胞色素c释放、Bid激活、PARP裂解这些细胞凋亡信号转导途径中特征性指标的相互关系，并以此推断缺血/缺氧后脑血管内皮细胞凋亡的发生过程，从而为预防或减轻缺血性脑损害寻找出可能的途径和有效的方法。 方法:为了进一步阐明OGD后鼠CECs的凋亡发生途径，我们采用MTT法和LDH法分析了OGD后CECs死亡的时间分布，采用酶法结合荧光法测定了OGD后CECs内凋亡执行因子caspase-3和凋亡启动因子caspase-8的活性变化情况。我们用Western blot方法检测了OGD后CECs中促凋亡的Bcl-2家族成员Bid的断裂和激活、可作为凋亡发生重要标志的caspase-3底物PARP的裂解和失活，以及procaspase-3和procaspase-8降解为活化的caspase-3和caspase-8的变化情况。采用免疫细胞化学染色和Western blot法，我们观察了OGD后CECs中凋亡的关键启动因子细<WP=64>胞色素c从线粒体中的释放。另外我们还研究了广谱caspase抑制剂zVAD-fmk对以上各凋亡相关因子的影响。 结果：OGD 1小时后鼠CECs无明显形态学改变，也较少发生细胞死亡，4小时或更长时间后细胞出现明显形态变化，细胞存活率随OGD时程的延长而逐渐降低。OGD后1小时鼠CECs内的caspase-3活性即较正常对照组有明显增高，并于OGD后4小时达到高峰。而OGD后1小时至4小时，caspase-8的活性也较正常对照组显著增高，但不及caspase-3明显。Western blot显示，鼠CECs内活性caspase-3的量在OGD后1小时即有明显增加，而活性caspase-8的量在OGD后4小时有明显增加。OGD后4小时无活性的原形Bid大量裂解为截短的活性Bid，OGD后8小时PARP大量裂解为无活性的片段。免疫细胞化学染色显示，OGD后细胞色素c在胞质内有弥散的重新分布，而未经过OGD时细胞色素c在胞内呈点状分布，这说明OGD后有大量细胞色素c从线粒体中释放出来，进入胞质。Western blot也证实OGD后有细胞色素c的释放。50μM的caspase抑制剂zVAD-fmk可抑制OGD后鼠CECs内caspase-3和caspase-8的激活，也同时抑制细胞色素c的释放及Bid的裂解激活，与此同时PARP的降解失活也被zVAD-fmk所抑制。<WP=65> 结论：以上实验结果证明，在OGD诱导的鼠CECs凋亡中有Bid裂解激活、细胞色素c释放、caspases激活和PARP断裂失活参与，细胞色素c的释放是这种凋亡过程中关键因素，而细胞色素c的释放受caspase（如caspase-8）的调控，caspase抑制剂zVAD-fmk可有效抑制PARP的失活，从而减轻凋亡的程度。Fas/TNF凋亡信号传导途径和线粒体凋亡信号传导途径都参与了这种OGD诱导的鼠CECs凋亡，在这两种信号转导途径之间可能存在一种相互交叉联系（cross-talk）。