1研究目的脊髓损伤是人类致残率较高的疾病之一,它不但在生理、心理上给患者带来痛苦,还使得患者及其家庭背负起沉重的经济负担。目前针对脊髓损伤的治疗尚无有效的治愈方法,是世界医学界极需攻克的难题及研究热点。脊髓损伤的病理机制十分复杂,其中神经营养因子(NTFs)及其受体变化是中枢神经系统损伤后的一个重要的病理反应,而NTFs的缺乏影响着脊髓损伤后期的神经修复。电针作为中医的一种传统治疗方法,已经引起越来越多的研究人员关注。本研究以与脊髓损伤神经修复关系密切的神经营养因子3(NT-3)作为切入点,选择督脉电针作为治疗脊髓损伤的干预手段,采用行为学、组织形态学及分子生物学等方法,探讨督脉电针对脊髓损伤大鼠受损脊髓组织NT-3不同受体介导的信号通路相关蛋白的影响,评价督脉电针对脊髓损伤的治疗效果,为临床治疗脊髓损伤或其他神经系统损伤的疾病运用督脉电针提供实验数据支持。2研究方法本研究以动物实验的形式展开,选用清洁级的SD大鼠作为研究对象,随机分为空白组(B组)、空白电针组(C组)、假手术组(S组)、模型组(M组)及督脉电针组(EA)5个组别,采用改良式的Allen’s打击法复制模型,督脉电针干预后分别于脊髓损伤后1d、3d、7d进行取材。取材前,采用BBB评分法对各组大鼠后肢运动神经功能进行评估,评价督脉电针对脊髓损伤后运动功能恢复的作用；采用HE染色、尼氏染色观察受损脊髓组织的病理改变及神经元细胞的情况,评价督脉电针对脊髓损伤后组织形态学的影响；利用TUNEL技术观察细胞凋亡情况,通过免疫组织化学法、Western blot等技术,观察督脉电针对脊髓损伤模型大鼠受损脊髓NT-3及其不同受体(TrkC、p75NTR)介导的信号通路相关蛋白MEK2、p-ERK1、p-JNK、p-c-Jun的影响,从宏观到微观不同层面探讨督脉电针对脊髓损伤的作用机制。3研究结果3.1 BBB评分法评估大鼠后肢运动神经功能,造模后1d：与B组、C组及S组比较,M组BBB分值明显减少,经统计学分析,有显著性差异(P<0.01),与M组比较,EA组BBB分值无明显统计学差异(P>0.05)；造模后3d：与B组、C组及S组比较,M组BBB分值明显减少,经统计学分析,有显著性差异(P<0.01),与M组比较,EA组的BBB分值有所增加,但经统计学分析,无显著性差异(P>0.05)；造模后7d,与B组、C组及S组比较,M组BBB分值明显减少,经统计学分析,有显著性差异(P<0.01),与M组比较,EA组的BBB分值有所增加,经统计学分析,有极显著性差异(P<0.01)3.2 HE染色结果评价大鼠受损脊髓病理改变,造模后1d,M组可见脊髓组织结构被破坏,灰、白质分界不清,灰质内斑片状出血,大量红细胞聚集,灰质区域的运动神经元肿胀,细胞间质水肿,细胞核固缩,白质神经纤维肿胀增粗,排列紊乱,EA组与M组病理改变相似；造模后3d,M组可见白质区域神经纤维继续出现肿胀增粗的情况,组织结构排列紊乱稀疏,甚至有空洞形成,并有小胶质细胞浸润,灰质部分大范围的运动神经元肿胀,甚至出现溶解,坏死,有白细胞浸润,中央管结构紊乱,EA组出血现象相对减少,其余病理变化开始出现改善；造模后7d,M组可见出血减少,白质与灰质的边界仍然模糊不清,灰质部位神经元数量极少,大量小胶质细胞增生,白质神经纤维结构肿胀明显,EA组出血减少,神经元开始出现清晰的边缘,也出现小胶质细胞的增生,但较M组相对要少。3.3尼氏染色结果提示大鼠受损脊髓神经元细胞情况,造模后1d,M组可见神经元数量减少,残存的神经元细胞出现不同程度的肿胀,尼氏体染色细胞减少,甚至消失,染色变淡,在中央细胞核部位最为明显,EA组组织形态病理变化改善不明显,神经元也有不同程度的减少,尼氏染色较淡；造模后3d,M组可见灰质区域中的运动神经元出现明显的萎缩,部分神经元溶解,尼氏体数量显著减少,甚至消失,EA组神经元萎缩、减少现象仍存在,但较M组神经元减少数量少,且尼氏体隐约可见；造模后7d,M组可见少量神经元尼氏体重现,EA组残存的神经元中的尼氏体重现,较M组明显。3.4 TUNEL结果提示大鼠受损脊髓细胞凋亡情况,造模后1d,M组与EA组的脊髓切片上可见有较多的阳性颗粒,主要分布在损伤的区域及其边缘,二者比较有统计学差异；造模后3d,M组阳性细胞增多明显,且分布范围扩大,灰质与白质均有阳性细胞的出现,凋亡细胞大小不一,EA组较M组有所减少,组间有统计学差异；造模后7d,M组凋亡细胞较前减少,EA组较M组阳性细胞数量减少更为明显,组间有显著性差异。3.5督脉电针对NT-3特异性受体TrkC介导的ERK通路的影响：免疫组织化学法及Western Blot检测结果显示,造模后1d、3d、7d,与B组、C组及S组比较,M组大鼠受损脊髓组织中NT-3、Trk C、MEK2、p-ERK1表达均有不同程度下降,与M组比较,EA组大鼠受损脊髓组织中NT-3、Trk C、MEK2、p-ERK1表达有不同程度的增加。3.6督脉电针对NT-3受体p75NTR介导的JNK通路的影响：免疫组织化学法及Western Blot检测结果显示,造模后1d、3d、7d,与B组、C组及S组比较,M组大鼠受损脊髓组织中P75NTR、p-JNK、p-c-Jun表达均有不同程度升高,与M组比较,EA组大鼠受损脊髓组织中P75NTR、p-JNK、p-c-Jun表达有不同程度的下调。4研究结论4.1 Allen’s打击法复制脊髓损伤模型能较好的模拟脊髓损伤的病理特征及临床表现,督脉电针治疗可以使脊髓损伤大鼠下肢的运动功能障碍得到改善,加快神经功能的恢复。4.2督脉电针治疗使脊髓受损大鼠神经元损伤情况得到改善,促进神经元的存活,并对神经元发挥一定的保护作用。4.3督脉电针治疗可以减少脊髓损伤大鼠细胞凋亡的发生,促进神经元存活,对受损神经的修复有一定的保护作用。4.4督脉电针治疗可以促进内源性NT-3及其特异性受体Trk C合成与分泌,并激活ERK信号转导通路,增加MEK2、p-ERK1表达,发挥保护神经元,促进神经元存活,抑制细胞凋亡的作用。4.5督脉电针治疗可以减少p75NTR受体的激活,抑制JNK通路活化,减少JNK、c-Jun的过磷酸化表达,达到抑制细胞凋亡的目的。