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肺结核病(pulmonary tuberculosis, PTB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的一种与机体细免疫应答密切相关的慢性感染性疾病,在肺结核病的发病过程中,细胞介导的抗原特异性免疫应答发挥着重要作用。当结核分枝杆菌感染机体时,抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)将结核分枝杆菌抗原通过抗原-MHC分子复合物和CD28-CD80双途径激活T淋巴细胞,同时分泌IL-12、IL-1等细胞因子,进一步刺激免疫细胞释放效应分子如TNF-a等以杀灭结核分枝杆菌。DNA甲基化修饰作为动植物体内一种重要的表观遗传修饰形式,参与免疫应答反应的调控,对肿瘤性疾病、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的发生发展中起着重要的作用。而DNA甲基化主要通过DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)上调DNA甲基化水平；通过DNA去甲基化酶(TET1、TET2、TET3、TDG)下调DNA甲基化水平,两方面的调节共同维持DNA甲基化水平的高低。课题组在前期通过全基因组DNA甲基化芯片研究发现,肺结核病患者宿主基因普遍呈低DNA甲基化状态。为进一步探索肺结核病人DNA甲基化调节的分子机制、研究肺结核病人DNA低甲基化状态的影响因素,本研究在前期研究结果的基础上,收集健康对照(γ干扰素释放实验,即IGRA阴性)和活动性肺结核病人治疗前全血RNA,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,首先对参与DNA甲基化下调的DNA去甲基化酶的4个基因进行定量检测,以初步明确DNA低甲基化状态与DNA去甲基化酶之间的关系。结果发现,在肺结核病人组中,参与下调DNA甲基化水平的4个基因(TET1、TET2、TET3、TDG)表达均显著升高(p值<0.05)。为了全面探讨肺结核病人DNA低甲基化状态的影响因素,我们又对可以被动影响DNA低甲基化状态的DNA甲基化转移酶的3个基因(DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B)进行了定量检测,结果发现：只有)NMT1表达显著升高(p值<0.05)。为了进一步验证,我们利用H37Rv裂解抗原以及体外降低DNA甲基化水平的5-氮杂胞嘧啶核苷(5azac)刺激物刺激A549、Beas-2B两种细胞系,并收集刺激后不同时间点细胞DNA、RNA。利用甲基化敏感性限制性分析(MSRA)对所收集DNA样本进行分析,结果表明,H37Rv抗原、5azac导致DNA甲基化水平降低,且刺激时间越长甲基化降低越明显。我们利用Real-time PCR(RT-PCR)方法对RNA样本进行检测。结果显示,在两株细胞中,DNA去甲基化酶随着刺激时间的延长逐渐升高,DNA甲基化转移酶表达的时间动态图却无明显特异性表达。且结果中在刺激第四天A549细胞中H37Rv刺激组DNA去甲基化酶TET2、TET3上调,而在Beas-2B中为H37Rv刺激组DNA去甲基化酶TDG上调,即DNA去甲基化酶表达显著升高,这与临床检测结果相符；在A549细胞H37Rv刺激组有两种DNA甲基化转移酶DNMT3A、DNMT3B上调,而在Beas-2B细胞H37Rv刺激组中表现为DNMT3A下调。综上所述,我们发现无论是临床肺结核病人组还是体外细胞实验H37Rv刺激组,DNA甲基化水平呈下降趋势,而DNA去甲基化酶差异性表达上调。并且在细胞刺激实验中,随刺激时间越长,DNA去甲基化酶表达逐渐升高,而DNA甲基化降低程度逐渐明显。总之,本研究验证了肺结核病人DNA甲基化呈现降低趋势,并初步回答了这种DNA低甲基化趋势可能主要受DNA去甲基化酶调控。