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第一部分己糖激酶2在喉鳞状细胞癌组织中的表达和临床意义背景和目的：喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,其中绝大多数为喉鳞状细胞癌（LSCC）。喉癌的发病率和死亡率呈上升趋势。这促使我们去深入研究LSCC的病因和发病机制。与正常细胞相比,肿瘤细胞的能量代谢改变如Warburg效应在肿瘤增殖、凋亡、转移等方面发挥重要作用。己糖激酶（Hexokinase, HK）是糖酵解途径中第一个反应的限速酶,研究发现,己糖激酶2（HK2）与恶性肿瘤关系最密切,在多种人肿瘤组织中表达升高。当前研究发现,HK2与线粒体外膜结合后可促进Warburg效应,并可能抑制线粒体诱导的细胞凋亡来促使肿瘤生长,因此被认为是干预肿瘤生长的理想分子靶点。目前HK2与头颈部鳞癌（HNSCC）发生发展的关系仅有零星报道,发现其可能在HNSCC中呈高表达,但缺乏深入的研究报道。本部分旨在研究HK2在LSCC中的表达特点,并分析其表达与临床病理参数的关系,探寻其临床意义。并在后续的研究中分析HK2的对肿瘤增殖及凋亡的影响。方法：收集了108例LSCC原发灶、24例喉乳头状瘤和21例声带息肉的石蜡标本,入组均为男性患者。应用免疫组化的方法检测HK2在上述组织的表达特点。HK2蛋白的表达结果据染色强度和阳性肿瘤细胞的百分比情况进行综合判定。并统计HK2的表达与临床病理参数的相关性。应用SPSS15.0统计学软件进行统计学分析。结果：LSCC与喉乳头状瘤或声带息肉组织中HK2表达差异有统计学意义（P均<0.001）。进一步分析发现,HK2的表达与肿瘤部位（P<0.001）、临床分期（P<0.001）有关。在声门上型LSCC标本中,HK2多呈高表达,而在声门型LSCC中多呈中到低度表达。HK2表达随肿瘤分期的升高而增加,在Ⅰ-Ⅱ期的组织多为中到低度表达,在Ⅲ-Ⅳ期中多为高表达。HK2表达强度与年龄无关（P>0.05）。结论：HK2在LSCC的表达较喉乳头状瘤或声带息肉升高。HK2的表达与LSCC部位及临床分期有关。第二部分靶向HK2基因shRNA真核表达质粒的构建和干扰效率鉴定目的：筛选HK2有效的干扰序列,为后续研究干扰HK2对喉癌细胞的增殖及凋亡影响打下基础。方法：按照RNA干扰靶点的设计原则,在BLAST网站进行同源分析,从人HK2基因（NM000189.4）编码序列中寻找出特异性序列为靶点。并按shRNA的设计方法,在靶序列的5’端和3’端加入相应的序列,并与线性化pGenesil-1.1质粒表达载体相连接,构建重组质粒pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control。重组质粒进一步转染人喉癌Hep-2细胞,转染48h小时后,分别测定各组细胞的HK2的mRNA及蛋白表达,确认HK2shRNA瞬时转染后的干扰效率。结果：经酶切鉴定和测序分析证实重组pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control构建成功。重组质粒转染Hep-2细胞48h后,检测HK2的mRNA表达,发现与未转染组和对照组相比,pGenesil-1.1-HK2-1和pGenesil-1.1-HK2-2质粒均显著降低HK2mRNA的表达（P<0.001）；其中pGenesil-1.1-HK2-2干扰效率（58.7+3.06%）高于pGenesil-1.1-HK2-1的干扰效率（45.3±3.51%）（P<0.05）。检测pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control转染细胞后的蛋白表达变化与mRNA结果相一致。结论：成功构建了pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2及pGenesil-1.1-control重组质粒,并在mRNA及蛋白水平证实pGenesil-1.1-HK2-1、pGenesil-1.1-HK2-2均可有效干扰HK2的表达,后者干扰效率稍高,选择用于后续试验。第三部分shRNA干扰HK2基因对人喉癌细胞株Hep-2细胞凋亡和增殖的影响目的：筛选shRNA干扰HK2的稳定转染细胞株,并在细胞水平研究shRNA干扰HK2对细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法：G418筛选,有限稀释法挑取单克隆细胞,形成稳定转染重组质粒pGenesil-1.1-HK2-2和pGenesil-1.1-control的Hep-2细胞株HK2shRNA及control shRNA。应用qRT-PCR及Western blot检测HK2shRNA及control shRNA的HK2mRNA及蛋白的表达,并利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）偶联比色法测定转染细胞的HK活性。应用MTT法检测shRNA干扰HK2对肿瘤细胞增殖能力的影响。用流式细胞仪检测shRNA干扰HK2对肿瘤细胞周期及凋亡的影响。结果：qRT-PCR及Western blot的结果显示,与control shRNA和未转染细胞相比,HK2shRNA组HK2mRNA及蛋白表达下降（P<0.001）。G6PDH偶联比色法检测显示,与control shRNA和未转染细胞相比,HK2shRNA组细胞的HK活性下降。MTT实验发现shRNA干扰HK2能抑制肿瘤细胞的增殖（p<0.05）。细胞周期检测显示shRNA干扰HK2能导致肿瘤细胞发生G0-G1期阻滞（P<0.001）。凋亡检测发现shRNA干扰HK2能促进肿瘤细胞发生凋亡（P<0.05）。结论：shRNA干扰HK2可抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,导致肿瘤细胞发生G0-G1期阻滞,是一个潜在的癌基因。第四部分shRNA干扰HK2基因对人喉癌细胞株Hep-2细胞裸鼠成瘤效应的影响目的：研究shRNA干扰HK2对人喉癌细胞株Hep-2细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响,并探讨裸鼠移植瘤增殖和凋亡的影响。方法：采用前期构建成功的稳定转染HK2shRNA质粒的人喉癌细胞株Hep-2进行裸鼠皮下移植瘤模型实验。将18只BALB/c-nu裸鼠随机等分成未转染组、阳性质粒转染组和阴性质粒转染组,均皮下注射2×106个细胞／鼠至裸鼠的右侧前肋皮下。观察肿瘤生长情况,定期记录肿瘤的长短径。4周后处死裸鼠,记录瘤重。并将瘤体包埋做成石蜡切片,行HE染色、Ki-67染色及TUNEL检测,了解在体内水平HK2干扰后对肿瘤细胞异型性、肿瘤增殖及凋亡的影响。结果：与未转染组和阴性质粒转染组相比,阳性质粒转染组裸鼠的肿瘤体积和瘤重明显降低（P<0.05）。HE染色显示,与未转染组和阴性质粒转染组相比,阳性质粒转染组肿瘤细胞异型性现象有所减轻。肿瘤组织行Ki-67染色发现,阳性质粒转染组的增殖指数（46.71士5.17%）较未转染组（70.30士4.92%）和阴性质粒转染组（67.14士4.76%）显著降低（P<0.01）。TUNEL法检测发现,阳性质粒转染组的凋亡指数（39.45+8.80%）较未转染组（16.67±6.56%）和阴性质粒转染组（19.57+7.16%）显著升高（P<0.001）。结论：裸鼠皮下移植瘤模型实验显示shRNA干扰HK2可以抑制肿瘤细胞的成瘤能力,其机制可能在于对增殖的抑制和对凋亡的促进作用,与体外实验结果相一致。