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宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的第二大原因,其发病率在过去几十年不断增加。虽然早期宫颈癌可以通过手术或放疗进行治疗,但晚期宫颈癌几乎是无法治愈的,需要新的治疗方法。放疗是宫颈癌的常规治疗手段,增强放疗的杀伤效应至关重要。线粒体是细胞中重要的细胞器,参与细胞各种活动,如能量产生、代谢、信号传导、细胞自噬与凋亡等多种活动,近年来线粒体和活性氧(ROS)作为癌症治疗靶点已成为热点。KillerRed(KR)是一种可遗传编码的二聚体红色荧光蛋白光敏剂,相对于化学光敏剂的主要优点是其在用适当基因转导可在肿瘤细胞中表达,并通过对靶细胞区室的精确损伤直接杀死细胞。在可见光照射下可产生大量ROS,利用ROS破坏癌细胞。本研究通过Pink1(PTEN induced putative kinase 1)的线粒体靶向序列(mitochondrial targeting sequence,MTS)介导KR亚定位于线粒体,进而可见光照射诱导ROS产生,从而增强电离辐射对宫颈癌的杀伤作用,并探讨其杀伤效应及分子机制。目的:研究Pink1线粒体靶向序列的线粒体亚定位功能,并以人宫颈癌HeLa细胞为对象,探讨可见光照射线粒体亚定位HeLa细胞的KillerRed诱导ROS生成的规律,其增强的辐射效应对HeLa细胞增殖抑制、线粒体失能、细胞凋亡和自噬的作用及分子机制,为肿瘤的治疗提供新的方法和实验证据。方法:1.利用基因重组技术分别构建Pink1-MTS介导的线粒体亚定位载体plxsp-flag-Pink1-mCherry(Pink1-mtmCherry)和plxsp-flag-Pink1-KR(Pink1-mtKR),并进行测序鉴定。将Pink1-mtmCherry瞬时转染COS-7和HeLa细胞,利用线粒体示踪蛋白COXⅣ与mCherry的表达进行线粒体亚定位鉴定;2.以人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,Pink1-mtKR粒瞬时转染后30 h,可见光照10、30和60 min后,分别于10、30和60 min加入DCFH-DA探针,检测可见光诱导ROS含量变化;3.X射线照射条件:使用X-RAD 320i X深部辐照仪进行照射,电压180 kV,电流20 mA,单次源靶距70 cm,剂量率1.0 Gy/min,本实验照射剂量4 Gy;4.质粒Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后30 h,进行可见光照30 min,12 h后给予4 Gy X射线照射,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化;5.质粒Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后给予可见光和X射线照射,分别利用生化试剂盒检测ATPase活性、ATP生成、线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ等线粒体失能指标的变化;6.质粒Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后给予可见光和X射线照射,分别利用罗丹明123(Rhodamine123)、AnnexinⅤ-FITC和单丹磺酰戊二胺(Monodansyl-cadaverine,MDC)染色,通过流式细胞术检测HeLa线粒体膜电位(?ψ_m)、凋亡和自噬的变化;7.质粒Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后给予可见光和X射线照射,利用实时定量PCR(quantatively real time PCR,qRT-PCR)和Western blot检测凋亡和自噬相关分子表达的变化,探讨线粒体亚定位KR增强辐射诱导Hela细胞凋亡和自噬的分子机制;8.实验数据以平均值±标准差(x±s)表示,利用SPSS 24.0进行统计学分析,利用GraphPad Prism5软件进行绘制柱状图,利用Student’s t检验进行组间比较,P<0.05被认为具有统计学差异。结果:1.成功构建线粒体亚定位的mCherry和KR重组表达载体Pink1的线粒体定位序列(mitochondrial targeting sequence,MTS)具有线粒体靶向特性,将Pink1-MTS构建在红色荧光蛋白mCherry和KR序列的上游,重组质粒mtmCherry和mtKR经过测序鉴定载体构建正确。2.Pink1-MTS的线粒体亚定位鉴定因KR蛋白具有光照后失去活性的特点,所以利用mCherry代替KR进行线粒体亚定位的鉴定。将Pink1-mtmCherry瞬时转染COS-7和HeLa细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光的COXⅣ与红色荧光的mCherry共定位,暗示Pink1-MTS可以将mCherry亚定位到线粒体上。3.可见光照射诱导线粒体亚定位KR在HeLa细胞ROS生成规律质粒Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后给予可见光照射10、30和60 min后,分别检测照射后10、30和60 min ROS的变化,结果显示:与Con组比较,空载体(Empty vector)组ROS变化不明显,而可见光照射10和30 min后可诱导Pink1-mtKR组ROS显著增加,且照射结束后60 min时ROS增加最明显(P<0.05),而可见光照射60 min时ROS则呈现降低趋势。4.Pink1-mtKR增强辐射对细胞增殖的抑制作用CCK8检测结果显示:可见光照射后,与Con组比较,empty vector组增殖能力基本不变,而mtKR质粒转染的HeLa细胞增殖能力显著降低(P<0.05),而4 Gy照射后HeLa细胞增殖抑制更明显。5.线粒体失能相关指标的变化Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后,给予可见光照射,线粒体膜电位显著降低,而4 Gy X射线照射后线粒体膜电位降低的更加明显;与Con组比较,Empty vector组ATP含量、ATPase活性以及呼吸链复合物I、III活性基本不变,而Pink1-mtKR组ATP含量和ATPase活性均显著降低(P<0.05),且线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ活性也显著降低,4 Gy照射后HeLa细胞的这些线粒体失能指标变化得更加明显。6.Pink1-mtKR增强辐射对细胞凋亡及Cyt c/caspase-3通路的激活Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后,给予可见光照射,HeLa细胞凋亡率显著增加(P<0.05),而4 Gy照射后细胞凋亡率增加更明显;与Con组比较,Empty vector组Cyt c、caspase-9和caspase-3 mRNA与蛋白表达基本不变,而Pink1-mtKR组Cyt c、caspase-9和caspase-3mRNA表达显著增加(P<0.05),总蛋白中Cyt c、断裂的caspase-9和caspase-3表达量均有显著增加,而线粒体蛋白中,Cyt c蛋白表达显著降低,同时4 Gy照射后HeLa细胞凋亡率更高,凋亡相关mRNA及蛋白表达更加明显,这些结果表明Cyt c/caspase-3通路被激活。7.Pink1-mtKR增强辐射对细胞自噬及Pink1/parkin线粒体自噬通路的激活Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后,给予可见光照射,流式细胞术结果显示HeLa细胞自噬率增加,4 Gy照射后自噬率更加显著(P<0.05);而且,与Con组相比,Empty vector组Tom 20和Pink1mRNA表达无明显差别,Pink1-mtKR组则明显增加(P<0.05);Empty vector和Pink1-mtKR组总蛋白中Pink1和parkin蛋白表达变化不明显,而Pink1-mtKR组p62以及LC3II/I比值增大,在Pink1-mtKR组线粒体蛋白中Tom 20、Pink1和Parkin表达都明显增加,这些结果暗示Pink1-mtKR诱导自噬增加,且为线粒体自噬,同时Pink1/parkin通路被激活。结论:1.成功地构建了线粒体亚定位融合表达载体Pink1-mtmCherry(KR),而且具有线粒体亚定位作用;2.Pink1-KR质粒经可见光诱导后,能导致HeLa细胞产生大量ROS,具有一定的时间规律;3.线粒体亚定位的KillerRed经可见光照射后可抑制HeLa细胞增殖,且可增强辐射的增殖抑制;4.KillerRed作用于HeLa细胞,可见光照射诱导线粒体失能,包括ATPase活性,ATP生成,线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ活性,以及线粒体膜电位降低,膜通透性增加等,且辐射诱导可增强上述表型变化;5.可见光照射导致转染Pink1-mtKR的HeLa细胞凋亡和自噬(线粒体自噬)的增加,且增强辐射诱导的上述表型变化,涉及到Cyt c/caspase-3的凋亡通路,以及Pink1/parkin/p62的线粒体自噬分子机制,为肿瘤的辐射增敏提供了新的思路。