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目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道常见的恶性肿瘤,在40~60岁为高患病率年龄段,是全世界癌症死亡的主要原因。在我国结直肠癌的发病率与死亡率位于全部恶性肿瘤的第4~6位,仅次于胃癌、肺癌及食管癌等常见恶性肿瘤。近年各地方资料显示随着国人生活水平的提高和饮食结构的改变,发病率呈上升趋势。结直肠癌的发生是一个多级的复杂的进程,包括抑癌基因突变和丢失,原癌基因激活等等。信号传导网络的异常在肿瘤发展的各个阶段贯穿。随着研究的深入,发现信号通路在肿瘤的发生和发展中具有重要的作用。细丝蛋白A(filamin A,FLNa)是结直肠癌细胞生长和转移中重要的抑制因子。FLNa表达降低或缺失与正常结直肠组织向恶性发展有关,但是,FLNa抑制肿瘤细胞侵袭性生长的具体机制尚不清楚。因此,揭示恶性肿瘤转移及其调控的确切分子机制已成为临床提高肿瘤治疗效果的迫切需要,这一领域也成为分子肿瘤学、分子生物学等基础理论学科研究的热点。本研究将探讨FLNa基因通过ERK通路抑制SW480细胞体外侵袭机制的研究。方法:1将FLNa基因质粒载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa,以脂质体介导方式转染SW480细胞。经G418筛选,获得FLNa基因稳定表达的SW480 /FLNa细胞。RT-PCR和Western印迹法检测FLNa基因的导入情况。2以SW480细胞及成功转染FLNacDNA的SW480/FLNa细胞作为研究对象,观察经U0126和EGF处理后,Western blot检测SW480和SW480/FLNa细胞质ERK(ERK)、细胞核内磷酸化ERK(p-ERK)和基质金属蛋白酶-9(matrix metallo proteinases-9,MMP-9)蛋白表达水平的变化。3分别检测SW480、经U0126处理20分钟后SW480和SW480/FLNa胞质ERK、胞核p-ERK、胞质MMP-9蛋白表达;检测SW480/FLNa、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa和SW480胞质ERK、胞核p-ERK、胞质MMP-9蛋白表达。4研究FLNa在ERK信号通路对SW480细胞体外侵袭转移能力的影响。结果:1 RT-PCR检测细胞FLNamRNA的表达结果显示,以GAPDH作内参照,以FLNa/GAPDH值来定量,SW480/FLNa、SW480 /pcDNA3.1和SW480细胞的mRNA表达水平分别为1.27±0.11、0.12±0.02和0.14±0.03。SW480/FLNa细胞FLNamRNA的表达明显高于对照组(。Fig.1)2 Western blot检测细胞FLNa蛋白的表达结果显示,以GAPDH作内参照,以FLNa/GAPDH值来定量,SW480/FLNa、SW480/pcDNA 3.1和SW480细胞的蛋白表达水平分别为0.78±0.03、0.01±0.00和0.01±0.00。SW480/FLNa细胞mRNA的表达明显高于对照组。(Fig.2)3 Western blot结果显示,经U0126处理5、10、20和30min后,SW480细胞质内ERK表达水平分别为0.91±0.03、0.85±0.01、0.14±0.02和0.13±0.04。经处理20min后,U0126对ERK的表达达到最大抑制效果(。Fig.3)4 Western blot结果显示,经EGF处理5、10、20和30min后,SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平分别为0.17±0.03、0.15±0.01、0.81±0.03和0.76±0.04。经EGF刺激20min后,细胞质内的ERK达到最高水平。(Fig.4)5 Western blot结果显示,SW480、经U0126处理20分钟后SW480和SW480/FLNa胞质ERK表达水平分别为:0.51±0.04、0.08±0.01和0.09±0.00;胞核p-ERK表达水平分别为:0.44±0.05、0.00±0.00和0.01±0.00;胞质MMP-9蛋白表达水平分别为:0.43±0.04、0.00±0.00和0.00±0.00。结果显示SW480细胞胞浆和胞核P-ERK的表达明显低于对照组。(Fig.5)6 Western blot结果显示,SW480/FLNa、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa和SW480胞质内ERK表达水平分别为:0.07±0.00、0.71±0.03和0.78±0.03;胞核内磷酸化ERK表达水平分别为:0.02±0.00、0.22±0.02和0.29±0.04;胞质内MMP-9表达水平分别为:0.01±0.00、0.61±0.05和0.42±0.04。结果显示EGF处理后SW480/FLNa细胞胞浆和胞核P-ERK的表达明显低于对照组。(Fig.6)7 SW480、经U0126处理20分钟后SW480和SW480/FLNa细胞的体外侵袭实验,结果显示,SW480、经U0126处理20分钟后SW480和SW480/FLNa组的穿膜细胞数分别为213±15、82±13和75±11。说明未转染FLNa的SW480细胞的迁移和侵袭能力均显著增高。(Table1)8 SW480/FLNa、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa和SW480细胞的体外侵袭实验,结果显示,SW480/FLNa、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa和SW480组的穿膜细胞数分别为54±12、125±15和130±14。说明转染FLNacDNA后,细胞的迁移和侵袭能力均显著降低。(Table2)结论:1分别以SW480、SW480/FLNa为对照组的实验结果表明,FLNa具有抑制SW480细胞质内ERK、细胞核内p-ERK、细胞质内MMP-9蛋白表达水平的功能。2本研究的体外侵袭实验表明,FLNa对SW480细胞的体外侵袭能力具有抑制作用。3 U0126对SW480细胞质ERK表达有抑制作用;EGF对SW480/FLNa细胞质ERK表达有增强作用。