基于固态纳米孔DNA降速的实验研究

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基因测序技术在解密基因的表达,以及研究生命科学等众多领域都发挥了重要作用。同时,基因测序对疾病的诊断和治疗等方面也具有重大意义。例如在2019年底,全世界范围内出现了新型冠状病毒肺炎(COVID-19),并迅速蔓延,科学家们通过基因测序的方法快速掌握了新冠病毒的核苷酸序列,同时通过核酸检测的方法来判断人体是否感染新冠病毒。又如利用基因测序技术在产前进行唐氏综合症的筛选等。DNA测序技术的发展和成熟已经为医学领域带来了伟大的革新。目前,纳米孔检测技术能够完成经济成本低、测序时间短的任务。相比较生物孔,固态纳米孔拥有孔径大小可调节、质量可靠稳定以及可集成度高等优势,成为下一代基因测序研究的重点。固态纳米孔测序过程中,一直无法回避的一个重大难题是:待检测的目标物质通过电场力的牵引作用通过纳米孔时的运动速度过快,导致系统难以采集到足够数量的有效信号,从而无法实现分析出待测物质特征的目的。本论文是以减慢DNA分子在固态纳米孔中的易位速度为目的,探究了能够有效延长DNA分子通过纳米孔时易位速度的多种实验方法。本论文的核心工作以及研究成果有:(1)使用机械分离的方法剥离出块状石墨烯,再使用湿式转移石墨烯薄膜的方法,实现石墨烯薄膜在氮化硅的基底上的稳定覆盖,最后使用聚焦离子束技术成功制备了石墨烯纳米孔和笼状结构纳米孔。通过对纳米孔进行特殊亲水性处理后,分别开展了检测DNA分子的实验。对比使用氮化硅纳米孔检测的实验结果,能够发现DNA分子通过石墨烯纳米孔时能够获得更长的过孔持续时间以及更明显的阻塞电流幅值。使用笼状结构纳米孔检测DNA分子的过程中,对比DNA分子正向过孔与反向出孔的信号特征存在着显著的差异,着重探究了腔室空间可用于实现单分子重复测序的广阔前景。(2)深入探究了改变各种实验条件,从而得到有效减慢DNA分子在纳米孔中易位速度的方法。根据开展的对照实验能够得到以下论断:通过施加更小的偏置电压能够减慢DNA分子的易位速度,但电流变化的幅值也会降低;缩小纳米孔的孔径使得DNA分子速度减慢的同时,变化电流的幅值会增大;电解质溶液为Li Cl时,DNA分子能够获得相比较在KCl或Na Cl溶液中更缓慢的过孔速度;降低溶液环境的温度以及增大纳米孔两端电解质溶液浓度梯度的方案,都能够达到减慢DNA分子在氮化硅纳米孔中运动速度的目的;通过增加电解质溶液的浓度也能够降低DNA分子的过孔速度。同时分析了不同电流信号可能对应的DNA在孔内占位的姿态,过孔的姿态也会影响着DNA分子在纳米孔中的持续时间,通过对比发现当DNA浓度增大时,DNA分子会趋向自身折叠和相互缠绕的状态通过纳米孔。(3)研究了将生物素、链霉亲和素以及磁珠结合在DNA分子末端的方法。获得有不同绑定物的DNA分子在纳米孔中易位产生的电流信号。当DNA分子末端绑定磁珠后过孔时,产生的持续时间相对是最长的,达到了200 ms左右。绑定链霉亲和素后的DNA分子过孔速度比只绑定生物素时要更慢,DNA分子仅绑定生物素也是能够达到减慢DNA分子易位速度的效果。此外重点探究不同强度的电压对链霉亲和素和生物素结合键的影响。实验结果表明施加更大的电压后,结合键存活时间存在明显变短的现象,DNA分子和磁珠越容易分离。(4)设计了一种专门适配于磁镊系统的液池和夹具,能够满足磁镊在操作空间上需求的同时也便于显微镜对芯片减薄区的观察。详细介绍了磁镊系统的重要组成部分以及使用磁镊控制DNA分子的具体方法。探究了运用磁镊系统控制微米级的磁珠,进而主动控制了DNA分子反向通过氮化硅纳米孔的运动过程,最终实现了对DNA分子运动速度的主动调控。
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