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脂肪代谢异常,如肥胖症(Obesity)和高脂血症(Hyperlipidemia)等疾病已成为严重危害人民健康的常见疾病之一。脂肪(Fat)是机体能量储存的一种重要方式,细胞内中性脂肪,如甘油三酯(Triglyceride,TG)和胆固醇酯(Cholesterol Ester,CE),主要以脂滴(Lipid Droplet, LD)的形式存在,脂滴广泛地存在于多种组织细胞中,如脂肪细胞、肝细胞、肾上腺皮质和肌肉细胞等。脂滴的表面是为单层磷脂结构,并镶嵌着多种脂滴相关蛋白(Lipid Droplet Associated Proteins)。脂滴相关蛋白在脂滴的分解、合成和融合过程中具有重要的作用。PAT家族蛋白在脂滴代谢过程中具有重要作用。1990年人们发现了脂滴表面的第一个蛋白Perilipin,此后陆续发现ADRP、TIP47、S3-12、Vimentin、Caveolin-1、CGI-58等许多蛋白也位于脂滴的表面,这些蛋白统称为脂滴相关蛋白。近年来蛋白质组学的研究方法应用于脂滴表面蛋白的分析,大大提高了脂滴相关蛋白发现的速度。通过蛋白质组学的分析,目前将脂滴相关蛋白主要分成三类:一类是与脂滴特异结合的结构蛋白,一类是与脂质代谢有关的酶类或转运体,还有一类是相关资料过少而尚未分类的蛋白。一些研究发现,在基础状态和激活状态时,都位于脂滴表面的结构蛋白有Perilipin、S3-12、Vimentin和ADRP;而TIP47、Caveolin-1和Tubulin只在刺激状态下出现在脂滴表面。不同条件下脂滴表面的蛋白种类和数量发生变化,提示这些蛋白可能是以脂滴表面为平台来发挥对脂滴代谢的调节作用。OXPAT是Perilipin的同源蛋白,但其主要分布于脂肪分解代谢速度较快的组织细胞中,如肝细胞和肌肉细胞。目前的研究发现,OXPAT能够激活PPAR途径,而促进细胞中脂肪酸的分解代谢。1.在本研究中,我们利用OXPAT特异性引物从小鼠肝脏的cDNA文库中克隆了OXPAT基因,经测序,与Genebank公布的一致。同时,我们构建了OXPAT与凝血素( Hemagglutinin , HA )基因融合表达质粒pCMV5-HA-OXPAT。通过转染COS7细胞,利用Bodipy 493/503进行脂滴染色,经荧光显微检测,我们发现OXPAT定位于脂滴表面,该结果与公布的研究结果一致。2.我们利用AdEasy-1腺病毒系统,构建了携带OXPAT的腺病毒。首先,通过分子生物学手段构建pShuttle-HA-OXPAT质粒。pShuttle-HA-OXPAT质粒经Pme I线性化后,与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行重组,获得pAd-HA-OXPAT质粒。利用Pac I线性化pAd-HA-OXPAT,采用Lipofectacmine 2000转染AD293细胞。转染的细胞在培养的第9天出现细胞病变效应(CPE),收集细胞,反复冻融裂解细胞,收集细胞裂解产物中的腺病毒。采用293T细胞测定病毒滴度,结果表明病毒的滴度大于2×109/ml,并能够有效在293T细胞中表达。3.我们研究发现OXPAT能够降低肝细胞中脂肪的含量和减小脂滴的体积。我们采用肝脏灌注和胶原酶消化的方法,分离小鼠的肝脏细胞,并在体外进行培养,分离的肝细胞的存活率大于95%。我们利用携带OXPAT的腺病毒感染体外培养的原代肝细胞,采用Western Blot检测OXPAT的表达,通过对肝细胞脂形态的观察,我们发现,OXPAT能够减小脂滴的体积,同时肝细胞中脂肪含量减少。综上所述,本研究从小鼠肝脏cDNA文库中克隆了OXPAT基因,并在COS7细胞中确定了其亚细胞定位。成功地构建了携带OXPAT的腺病毒,在体外成功地培养了小鼠原代肝细胞,并利用腺病毒感染肝细胞确定OXPAT对肝细胞脂肪含量和脂滴形态的影响。本研究为研究OXPAT在肝脏中的功能及其机制提供了研究基础。