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脊椎动物体色白化现象在自然界中较为常见,特别是长期生活在黑暗环境中的典型洞穴鱼体色的白化尤为普遍。我们对贵州省荔波县的两种典型洞穴岭鳅属鱼类(大七孔岭鳅(Oreonectes daqikongensis)和佳荣岭鳅(Oreonectes jiarongensis))的实验室饲养观察中发现,大七孔岭鳅白色体色无变化与在洞穴中体色一致,但佳荣岭鳅的白色体色在光下饲养14天后体色变化为黑色。因此本研究以大七孔岭鳅和佳荣岭鳅作为研究对象,利用RNA-seq高通量测序技术对这两种岭鳅皮肤进行转录组分析,并对参与黑色素合成的主效候选基因(MC1R、OCA2、TYR)进行PCR扩增,进一步研究大七孔岭鳅和两种体色的佳荣岭鳅皮肤中色素形成相关基因存在和表达情况。通过比较两种岭鳅转录组中差异表达基因,发掘与体色形成有关的关键基因和通路。体色形成关键基因的发掘为后续功能研究与洞穴生物的适应性进化分析提供了科学基础。主要的研究内容如下:1.利用RNA-seq高通量测序技术获得了大七孔岭鳅皮肤组织中clean reads为11.95Mb。进一步去冗余、组装后分别得到Unigenes66647条;白化型佳荣岭鳅皮肤组织中clean reads为23.56Mb。进一步去冗余、组装后得到Unigenes 69568条;黑色型佳荣岭鳅皮肤组织中clean reads为24.06Mb。进一步去冗余、组装后得到Unigenes 76564条。KEGG和COG功能注释发现两种岭鳅属皮肤中表达基因在功能分类没有明显差别。2.在大七孔岭鳅中黑色素合成的相关基因MC1R、OCA2、MITF、TYR、TYRP1、DCT不表达,与之相反L-tyrosine有表达且表达量为13.78。两种表型佳荣岭鳅皮肤转录组的比较分析得到白化型佳荣岭鳅中差异表达量低的基因数为14533个,参与黑色素合成的相关基因均有表达,但其表达量比黑色表型佳荣岭鳅低。KEGG分析发现,在大七孔岭鳅和佳荣岭鳅的氧化磷酸化、三羧酸循环和脂肪酸合成、戊糖途径中大七孔岭鳅有较多的相关基因表达量为上调;而参与黑色素合成通路、丝裂原激活蛋白激酶通路、脂肪消化与吸收通路、酪氨酸代谢通路中大七孔岭鳅中相关基因差异表达量为下调,推测该现象与大七孔岭鳅和佳荣岭鳅长时间生活于洞穴环境需要增加清醒时间和增加觅食时间等生理调节有关。3.结合转录数据,通过PCR扩增了大七孔岭鳅(Oreonectes daqikongensis)和佳荣岭鳅(Oreonectes jiarongensis)黑色素合成主效基因:MC1R基因。获得大七孔岭鳅和佳荣岭鳅MC1R基因编码区序列为937bp和988bp;对MC1R基因序列进行近缘物种的同源序列比对和对氨基酸序列预测,研究结果表明,与正常黑色体色的地表鱼相比,大七孔岭鳅的MC1R基因编码区序列中有一段长度为29bp的核苷酸序列缺失,该核苷酸片段的缺失使得MC1R基因编码蛋白质的序列发生移码突变,在第84位氨基酸位点出现了终止密码子(TGA),移码突变导致该基因功能丧失,使得黑色素合成过程无法继续,从而使大七孔岭鳅形成白化表型。在佳荣岭鳅的MC1R基因中没有发现突变位点。同时也扩增了OCA2基因的外显子21和24和TYR基因的外显子4,验证了大七孔岭鳅和两种不同表型的佳荣岭鳅的OCA2基因外显子21和24和TYR基因外显子4序列没有发生与墨西哥脂鲤一致的突变。4.佳荣岭鳅体色候选基因的扩增中未发现导致其体色变化的突变位点。在转录组数据分析中所有参与黑色素合成的相关基因均有表达,因此认为合成黑色素的基因没有直接对佳荣岭鳅体色变化产生影响。但在与体色调节相关的神经激素表达分析中发现,儿茶酚胺、黑色素聚集素等使色素颗粒聚集的神经激素在白化型佳荣岭鳅中的表达量显著高于黑色表型的佳荣岭鳅和大七孔岭鳅。而乙酰胆碱和促黑色素激素等使色素颗粒扩散体色变黑的激素在白化型佳荣岭鳅中不表达。因此,推测神经激素的调节是引起白化型佳荣岭鳅在光下体色变黑的主要原因。