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本文对冬凌草甲素(oridonin)体外诱导人表皮癌A431细胞死亡机制进行了较为系统的研究，主要对冬凌草甲素在诱导A431细胞凋亡、酪氨酸激酶活力抑制和自噬三方面死亡机制进行深入的探讨。同时本文也对冬凌草甲素诱导A431细胞酪氨酸激酶活力抑制与凋亡，以及诱导自噬与凋亡之间的关系进行了较为系统的研究。在冬凌草甲素诱导A431细胞凋亡的实验中，我们发现A431对冬凌草甲素较为敏感，测得6、12、24、和36小时的IC50值份别为：144.29、62.12μmol／L、23.56μmol／L和16.64μmol／L。实验结果表明，冬凌草甲素能时间、剂量依赖地抑制A431细胞的生长。Hoechst 33258荧光染色后证明20μmol／L冬凌草甲素作用A431细胞24小时时出现明显的凋亡小体，乳酸脱氢酶(LDH)活力测定进一步证明凋亡的比率为30.1％，而且在48小时凋亡的比率最高(52.6％)，坏死比率几乎不变。但在60小时时，20μmol／L冬凌草甲素作用A431细胞凋亡比率明显下降，坏死比率明显上升。然而，40μmol／L冬凌草甲素作用于细胞，坏死的比率明显高于凋亡的比率。DNA电泳及流式细胞术进一步证明冬凌草甲素诱导A431细胞死亡是平衡于凋亡与坏死之间。合适剂量的冬凌草甲素则可诱导A431细胞凋亡。免疫印迹法结果提示，冬凌草甲素作用细胞24h时，procaspase-3开始被降解，同时activated caspase-3的表达该开始升高。且caspase-3的底物——ICAD、无活性的PARP蛋白被降解，释放出激活caspase-3的核酶(CAD)引起细胞凋亡。以上结果提示caspase-3被激活。在线粒体途径中，流式细胞术分析、形态学观察发现冬凌草甲素可以显著降低线粒体膜电位。同时下调凋亡抑制性蛋白Bcl-2的表达，但对促凋亡蛋白Bax的表达没有影响，即改变了Bax／Bcl-2的表达比率；同时促进cytochrome c释放到胞浆中。表明线粒体途径参与冬凌草甲素诱导的A431细胞凋亡。此外，在冬凌草甲素又通过抑制PI3K／Akt通路来诱导细胞凋亡，24h时又使肿瘤抑制因子p53蛋白发生磷酸化，抗凋亡的去乙酰化酶SIRT1蛋白的表达下调，提示PI3-K／Akt信号通路的抑制导致p53的激活，其中SIRT1表达的下调也与p53的激活有着密切的关系。在研究冬凌草甲素诱导A431细胞酪氨酸激酶活力抑制与凋亡的实验中，我们将冬凌草甲素和酪氨酸激酶抑制剂genistein(阳性对照药)对细胞的酪氨酸激酶活力抑制作用进行比较，发现同浓度的冬凌草甲素对细胞总酪氨酸激酶活力的抑制作用强于genistein。流式细胞术和DNA片断化分析结果发现genistein并不诱导A431细胞发生凋亡。免疫印迹结果显示，冬凌草甲素与genistein相比显示出更明显的下调表皮生长因子受体(EGFR)的表达，并抑制EGFR的磷酸化。同时，免疫组化结果发现冬凌草甲素还影响EGFR在细胞膜上的定位而genistein则没有明显的作用。提示冬凌草甲素抑制A431细胞酪氨酸激酶的活力是其诱导细胞死亡的主要因素之一。根据上述结果，我们对冬凌草甲素诱导A431细胞凋亡的机制进行了探讨。冬凌草甲素能时间依赖地下调EGFR的表达和抑制EGFR酪氨酸的磷酸化。在冬凌草甲素作用下，EGFR下游的效应蛋白：生长因子受体结合蛋白-2(Grb2)、Ras、Raf-1及细胞外信号调节激酶(ERK)的表达也明显的降低。热休克蛋白90(Hsp90)为Raf-1的伴侣蛋白，它能增加Raf-1的活力促进细胞增殖。免疫印迹结果表明，在冬凌草甲素作用下，Hsp90蛋白的表达没有变化，但Raf-1的表达却下调，提示冬凌草甲素可能不依赖于Hsp90来抑制Raf-1的活力。进一步的实验结果表明：Ras、Raf-1及ERK抑制剂显著增强冬凌草甲素诱导的A431细胞凋亡，提示Ras／Raf／ERK信号通路的失活部分参与了冬凌草甲素诱导的凋亡。以上结果说明：冬凌草甲素在诱导A431细胞凋亡的同时，抑制A431细胞总的酪氨酸激酶活力，进而引起EGFR酪氨酸的磷酸化水平下调，这一作用导致EGFR下游的效应蛋白的活化及信号通路的激活受到抑制，进一步增强了冬凌草甲素诱导的A431细胞凋亡。在冬凌草甲素诱导A431细胞自噬的实验中，我们发现Ras抑制剂显著增强了冬凌草甲素诱导的自噬，而Raf-1及ERK的抑制剂并无此作用。同时免疫印迹分析结果表明：抑制Ras的活力可以显著增强冬凌草甲素对Ras蛋白表达的下调的作用以及对PI3-K下游的效应分子—Akt活化的抑制作用，提示Ras／PI3-K，而不是Ras／Raf／ERK信号途径参与冬凌草甲素诱导的自噬。PI3-K抑制剂及Akt抑制剂可增强冬凌草甲素诱导的凋亡却抑制其诱导的自噬。然而，在冬凌草甲素单独作用下或提前加入Ras抑制剂时，促自噬蛋白Beclin-1的表达却下调，提示该蛋白并未参与冬凌草甲素诱导的自噬。另外，形态学观察、DNA片断化分析及LDH活力测定表明3-MA(自噬的抑制剂)能增强冬凌草甲素诱导的凋亡，表明在A431细胞中，冬凌草甲素诱导的自噬是作为细胞自我保护的机制对抗凋亡的发生。而且进一步的实验结果提示抑制Ras的活力可以增强冬凌草甲素诱导的线粒体膜电位的下降和Bcl-2蛋白表达的下调。这些结果都证明了在冬凌草甲素作用下，Ras参与了抑制自噬的作用，这与Ras激活Ⅰ型PI3-K有着密切的关系。而且线粒体膜电位的下降和Bcl-2蛋白表达的下调也可能部分地参与了该自噬过程的启动。本文在证明冬凌草甲素对人表皮癌A431细胞有很强的细胞毒作用，并首次探讨冬凌草甲素诱导A431细胞死亡的机制。