缢蛏转录组文库构建及3个生长基因修复功能初步研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:jioowewi
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缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)是我国重要海产滩涂贝类之一,与牡蛎、泥蚶、文蛤一起被称为我国四大养殖贝类。对缢蛏生长基因的研究对缢蛏育种、养殖等有重要意义。本研究建立了缢蛏转录组文库,从中获得缢蛏肌肉生长抑制素基因(Myostatin)、表皮生长因子受体基因(EGFR)和成纤维细胞生长因子受体基因(FGFR)序列,分别对他们的分子特性进行分析,并利用实时荧光定量PCR技术分析这三个基因在不同组织和发育阶段以及水管受创后的表达情况及修复功能。1.缢蛏转录组特征分析,注释添加以及分子标记多态性分析采用新一代454GS FLX高通量测序技术,首次构建了缢蛏转录组文库,共拼接得到859313条reads,平均长度为486bp。经过筛选获得147669条非冗余EST,有14615条EST(9.9%)与已知基因显著匹配,其中重叠群(contig)与单一序列(singleton)分别占21.0%和79.0%。通过与蛋白质库比对,将基因语义注释匹配到对应的序列片段后,共获得4724条GO分类信息,主要分为三大类:分子功能、生物学过程及细胞组分。筛选获得了一系列与缢蛏生长相关的基因,包括生长因子、生长因子受体以及生长因子结合蛋白,这些基因在双壳贝类中研究较少,对这些基因的进一步研究有助于从分子生物学角度阐明缢蛏生长发育机制。除获得片段序列,还在转录组中得到13563个SSR标记与13634个SNP位点。设计55对引物对挑选出来的SSR标记进行多态性分析,发现其中19对引物没有特异性产物;10对引物仅扩增出单倍型PCR产物;在剩下26对引物的产物中发现多态性。设计引物对25个挑选得到的SNP位点进行扩增,所有的位点都呈现出多态性。2.缢蛏肌肉生长抑制素基因(Myostatin)分子特性,表达分析与SNP关联分析从文库中筛选出1条Myostatin部分序列,通过RACE技术获得全长cDNA,其中开放阅读框为1362bp,可编码454个氨基酸序列。3’UTR和5’UTR分别为2342bp和189bp。该基因具有典型的蛋白酶水解位点,在蛋白结构上分别发现一个TGF-β前肽,成熟肽以及TGF-β蛋白结构域。通过qRT-PCR,发现该基因在缢蛏担轮幼虫期表达量最高,D-型幼虫和稚贝中较少表达;同时该基因在各组织有有广泛表达,其中斧足和性腺中的表达量较高。为了解该基因在缢蛏伤口修复过程中的作用,设计了修复实验。从表达谱中发现出水管、进水管和肝胰腺都呈现了先上升后下降的趋势,而Myostatin基因在斧足中的表达基本不变。在Myostatin基因上找到出10个SNP,设计引物在190个缢蛏个体上进行关联分析,发现其中5个位点与生长性状显著相关。3.缢蛏表皮生长因子受体(EGFR)表达分析从文库中筛选出1条EGFR部分序列,用荧光定量PCR技术,获得缢蛏EGFR基因在发育阶段和组织中的表达谱。该基因在6个发育阶段中的mRNA表达量变化不大,在D-型幼虫阶段略有下降;同时在组织表达中发现EGFR基因在性腺中表达量较高,可能与EGF-EGFR参与受精卵增殖分裂有关。在修复实验中,EGFR基因在出水管,进水管和斧足的表达量显著上调。随着表皮组织愈合而逐渐下调。这些结果表明EGFR基因在缢蛏生长发育及组织修复中发挥了重要作用。4.缢蛏成纤维细胞生长因子受体(FGFR)表达分析从文库中筛选出1条FGFR部分序列,设计引物并利用荧光定量PCR技术,获得FGFR基因的表达情况。该基因mRNA在缢蛏6个发育阶段中表达量总体上呈现逐渐下调趋势,但在D-型幼虫阶段出现明显滑落;组织表达中FGFR基因在斧足和性腺中的表达量较高。在修复实验中,EGFR基因在出水管、进水管和斧足的表达量显著上调。随后在第4d开始下降。结果证明FGFR基因在缢蛏生长发育及创伤修复中起到重要作用。
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