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海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布且具有重要生态功能的真核浮游植物,尤其是亚极地高纬度海域的赤潮优势种。E.huxleyi中的一些类群能够在细胞表面形成钙化的“球石粒”并具有高产DMSP的能力。自然海域中,某些E.huxleyi株系能够被特异性病毒（E.huxleyi virus,EhVs）感染,并诱导宿主细胞裂解死亡以控制赤潮消亡及宿主的种群动力学过程。病毒裂解球石藻造成DMSP的释放,球石粒大量产生、脱落及沉积,影响水体及大气中CO2含量,加剧温室效应;同时细胞裂解时CaCO3沉积于海底并参与生物圈的碳循环及地质演变。因此,E.huxleyi是当今研究全球生物地化循环及气候变化的一个关键物种,并由于该藻赤潮的瓦解有赖于病毒感染而更显重要。然而,目前我们对病毒感染过程中球石藻细胞的生理生化反应、病毒增殖的分子生物学机理、病毒与细胞相互作用的生物学意义等科学问题的认识还十分有限。MicroRNA（miRNA）是近年来发现的在真核生物中起转录后调控作用的小分子非编码RNA,它们通过复杂的调控网络调节基因的表达,在细胞分裂增殖、分化、凋亡及病毒感染的免疫应答等生命活动中发挥重要作用。近年越来越多的研究证实病毒和宿主都可以编码各自的mi RNA,miRNA是错综复杂的宿主-病原菌相互作用网络中的关键效应因子。病毒对宿主高度专一的依赖性导致它们对宿主细胞多样性的环境变化非常敏感。宿主可以利用其编码的miRNA干扰病毒的增殖,而病毒也可以通过类似的机制对抗或调节宿主以满足其需求。因此miRNA在病毒-宿主相互作用过程中具有非常重要的调控作用。迄今为止,有关浮游植物miRNA的研究报道甚少,而miRNA与浮游植物病毒感染的相关性研究尚未见报道。已有的海洋球石藻E.huxleyi CCMP 1516和其特异性裂解病毒EhV86的全基因组信息为我们从miRNA角度探索球石藻病毒与宿主相互作用的分子机制提供了机会,将有助于我们在分子水平上更好地理解海洋球石藻及其特异性病毒的生物学特性。本研究拟以海洋球石藻E.huxleyi BOF92及其特异性裂解病毒EhV99B1为研究对象,利用Illumina高通量测序技术并结合生物信息学以及现代分子细胞生物学方法,构建病毒感染相关miRNA表达谱,筛选和验证病毒感染差异表达的miRNAs;预测分析差异表达mi RNA的靶标,对靶基因进行KEGG/GO功能分析并构建miRNA-mRNA调控网络;确定关键的靶基因并实验验证miRNA与靶标之间的结合方式及可能的调控方式。主要研究结果如下:（1）以具有全基因组注释的E.huxleyi CCMP1516及EhV86为参考基因组,鉴定出42条mi RNAs且全部为novel miRNAs,其中8条发生了差异表达,将其命名为mir 1mir9（mir 5由于长度过长将其剔除）,mir 1mir 7为宿主miRNA,mir 8和mir 9为病毒mi RNA;42条成熟体miRNA长度范围为18-30 nt,具有33条pre-miRNAs,长度跨度为39-85 nt;大约70%的miRNA来自于外显子区和内含子区,首位碱基对C有着较强的偏好;42条mi RNA与miRBase数据库中已知的miRNA均缺乏同源性,即便是E.huxleyi BOF92和E.huxleyi CCMP 1516两个不同株系间的miRNA比对也未能找到同源序列,可能这些mi RNA在病毒感的E.huxleyi BOF 92中特异存在。（2）GO和KEGG分析显示,8条差异表达miRNA的靶基因富集于脂类代谢、鞘脂类代谢、细胞凋亡过程、细胞自噬调控、光合作用及细胞周期等过程;通过Cytoscape软件构建差异表达miRNA及其靶基因互作网络,结果表明,mir 6调控的靶基因最多,处于核心地位,调控能力最强,与其它miRNA和靶基因构成联系紧密的复杂网络,影响着整个网络的稳定性,其次为mir 7、mir 8和mir9;这些miRNAs倾向于拥有更多的共调控伙伴,可能在上述代谢通路中具有更为重要的作用;病毒miRNA（mir8,mir9）未出现在早期感染的宿主细胞中,似乎感染早期宿主mi RNA对细胞代谢的调控更为重要,而感染后期病毒mi RNA介入调控。（3）对8条差异表达的miRNA以及富集于细胞自噬、凋亡、光合作用、细胞周期、脂类代谢等通路的部分感兴趣靶基因进行荧光定量验证,结果显示,mir 6、7、8、9的表达趋势与测序结果相一致,且在感染组样品中的表达均显著升高,说明这些miRNA与病毒感染密切相关。靶基因荧光定量结果显示,病毒感染后,细胞周期调控相关基因Cyclin和CKS、光合作用相关基因PBSO、甾醇代谢相关基因PSAT及鞘脂类代谢相关基因hSPT的表达均明显下降;而自噬相关基因ATG 3、ATG 7、ATG 13、VPS 34及细胞凋亡特征蛋白metacaspase的表达则明显升高;此外,病毒的核酸内切酶（endonuclease）、DNA聚合酶（DNA polymerase）、丝氨酸棕榈酰转移酶（vSPT）及病毒外壳蛋白（MCP）等四个靶基因的表达水平在感染后期（45 h）较感染早期（6 h）也有所升高。综上所述,miRNA与靶基因之间的表达既具有正相关性,也具有负相关性,这就意味着病毒感染相关miRNAs对上述靶基因的调控可能既存在抑制方式,也存在激活方式。（4）对病毒mir 8和mir 9与自噬相关基因ATG3（17287351）、ATG13（17261891）、VPS34（17269912）以及VPS34（17275006）之间进行了精确的结合位点预测,发现miRNA与这些靶基因之间存在多样性结合方式,既能结合在靶基因的3’UTR,也可以结合在CDS区和5’UTR。我们选择部分结合于3’UTR和CDS的靶基因,利用psiCHECK2双荧光素酶报告系统进行结合位点的验证。分别构建了psiCKECK2-ATG3-CDS、psiCKECK2-ATG13-3’UTR及psiCHECK2-VPS34-CDS等野生型和突变型双荧光素酶重组载体,并将重组载体与miRNAs共转染hepG2细胞。结果显示,mir 9可显著抑制psiCKECK2-ATG13-3’UTR的相对荧光素酶活性,说明ATG13很可能是mir 9的靶基因;mir 8、mir 9则能分别显著上调psiCKECK2-ATG3-CDS和psiCHECK2-VPS34-CDS相对荧光素酶活性,表明ATG3、VPS34很可能是mir 8、mir 9的靶基因;其他转染组间相对荧光酶活性无显著变化,则它们之间可能不存在靶向关系。