脑卒中以高发病率、高死亡率、高致残率成为严重威胁人类健康及社会发展的主要疾病之一。脑卒中是指以脑细胞死亡、功能缺陷、神经系统功能障碍为主要症状的一类脑部血液循环障碍性疾病。因其性质不同可划分为缺血性脑卒中和出血性脑中风两大类。缺血性脑卒中占以上两种卒中的60-70%。基础和临床科学领域研发了多种治疗手段致力于中风后功能恢复,主要有溶栓治疗、康复治疗、经颅磁刺激。临床实践表明,除有4.5小时时间窗限制的溶栓治疗,至今未有一项干预治疗能够实现预期的最佳疗效,这可能是由于其他治疗方案具有非特异性靶标的缺陷,也可能与脑网络的复杂冗余有关。而新兴的光遗传学技术能够精确调控特定类型的神经元活动来控制大脑神经环路,并借用康复治疗的原理(始终给大脑损伤区一个有益的输入活动)以期实现缺血后功能恢复的目的。我们希望通过本课题的研究,能够从宏观角度进一步阐述脑卒中的病理机制,能够为临床医学使用光遗传学手段治疗脑卒中疾病提供新的可能与机制方面的理论依据。脑卒中的主要症状除运动功能障碍,也包括学习记忆、语言、情感等高级脑功能受损,说明脑卒中的梗死范围可能不仅仅局限于躯体感觉及运动皮层,也可能存在于海马及杏仁核边缘系统的功能核团,现今对于运动皮层缺血的研究已较为普遍明确,而对于深部核团缺血及相关功能恢复的研究少之又少。故本课题以海马及杏仁核深部脑区缺血为切入点,运用在体多通道记录技术研究学习与恐惧记忆功能相关脑区的环路水平发病机制,并结合光遗传学技术调控环路上游兴奋性,以期探究与恐惧记忆相关的外侧杏仁核局部缺血后的功能恢复及环路水平机制。研究结果如下： (1)内皮素(ET-1,Endothelin-1)收缩血管法与大脑中动脉栓塞法(MCAO,Middle Cerebral Artery Occlusion)是大鼠局灶性缺血的主要模型。其中脑中动脉栓塞法因缺血位置主要固定在纹状体及皮层而不适用于深部脑区缺血研究。而内皮素收缩血管法缺血病灶仅维持三天便出现自恢复现象,不能够有效模拟脑卒中带来的长时程行为学损伤。我们改进经典的光化学诱导法参数,以532nm激光,光强为30 mW/mm2,局部照射1 h,实现了背侧海马(DH,dorsal hippocampus)及外侧杏仁核(LA,lateral amygdala)的局灶性缺血,并且自恢复时间较长(7天内不能自行恢复),能够适用于长时程的行为学功能检测,缺血造模动物未出现基础活动能力异常。(2)背侧海马及外侧杏仁核缺血分别影响背景相关条件恐惧记忆和声音相关条件恐惧记忆的获取与唤起,提示这些脑区的缺血可分别影响其对应的脑功能。(3)本课题在此基础上进一步观察背侧海马及外侧杏仁核缺血后局部场电位(LFP, Local Field Potential)的分频段能量谱变化,发现生理状态下外侧杏仁核参与声音相关条件恐惧获取阶段,条件刺激区段内(CS,Conditional Stimulus,tone)能量均有显著升高,并且条件刺激内总能量的上升主要与theta及gamma频段有关；而在缺血状态下外侧杏仁核参与声音相关条件恐惧获取阶段,初期的声音条件刺激内区段和声音条件间隔(ITI,Inter-Trial Interval)区段能量呈现上升的趋势,之后总能量呈现逐渐下降的趋势,theta及gamma频段主要参与该过程；在生理状态下,外侧杏仁核参与声音相关条件恐惧唤起阶段,不与非条件刺激配对的条件刺激(tone)总能量有明显升高,theta、gamma频段能量仅在初期的条件刺激区段上升,可能是因为唤起过程中不配对条件刺激(CS, Conditional Stimulus,tone)及非条件刺激(US,Unconditional Stimulus,foot shock)随着CS一次次刺激,弱化了声音相关的条件恐惧记忆；而缺血状态下,外侧杏仁核参与声音相关条件恐惧的唤起阶段,各区段的能量并未明显变化,theta及gamma节律能量也未见显著上升,这些结果提示背侧海马缺血及外侧杏仁核缺血显著抑制了局部场电位的能量及delta、theta、beta、gamma分频段能量,其原因可能与缺血状态下,脑区之间的纤维投射、突触联系中断有关。 (4)在成功构建光遗传动物模型后,我们认为,在环路水平,这种利用光遗传技术特异性调控缺血后功能恢复的方法也许是治愈脑卒中疾病的新的可能。综上所述,本课题成功建立了深部脑区局灶性缺血模型,并且缺血时间能够达到7天,适用于长时程的行为学检测,深部脑区缺血模型能够引起相应高级脑功能受损,模拟缺血性卒中的主要症状。我们后续将采用在体多通道记录技术结合光遗传学方法,在外侧杏仁核上游脑区AuV给予光刺激,同时在AuV脑区及LA区域进行记录,深入研究AuV及LA两脑区的脑电节律的变化,探究单脑区细胞群内或多脑区之间的高频gamma与低频theta震荡的关联模式,为阐明恐惧记忆功能恢复的环路机制提供实验依据。