论文部分内容阅读
基因组上的遗传变异是研究动物表型性状差异的重要基础。目前，在牛上已有多个品种的全基因组变异信息被公布，并且通过生物信息学分析，预测出了很多与家畜肌肉生长、脂肪代谢、繁殖力和抗病性等数量性状相关的位点。然而，中国黄牛的全基因组变异研究尚未见报道。关于全基因组变异检测的方法主要有SNP（Single nucleotidepolymorphism）芯片、CGH（Comparative genomic hybridization）芯片和高通量测序等，其中，高通量测序技术能够全面、准确的获取基因组上的全部遗传信息，因而应用较为广泛。本研究采用测序技术系统检测了2个中国地方黄牛品种（南阳牛和秦川牛）的基因组变异，并比较分析两个品种间、中国地方黄牛与国外牛品种基因组DNA上的差异。同时，研究拷贝数变异（Copy number variation, CNV）对功能基因的表达及相关性状的影响，最后，深入分析了牛配对盒7（Paired box7, Pax7）基因启动子区的一处短片段拷贝变异对启动子活性、基因表达和表型性状所产生的剂量效应。本研究主要取得了如下结果：1.黄牛全基因组变异检测及分析本研究对南阳牛和秦川牛基因组进行高通量测序，其测序平均覆盖深度分别是9.37倍和11.76倍，共得到约67Gbp的数据量。将所得的reads与牛参考基因组（BostaurusUMD3.1）比对后，在南阳牛和秦川牛基因组分别检测到9,008,518和6,963,517个SNP位点，其中新发现的SNP分别占50.83%和29.02%。对变异位点的进一步注释发现，南阳牛基因组突变（包括SNP和Indels）的丰富程度大于秦川牛，并且在外显子、内含子和基因间区均表现出同样的差异。而这种差异可能是由于品种起源不同造成的，进化分析表明，南阳牛很有可能主要是瘤牛（Bos taurus）起源的；而秦川牛可能主要是普通牛（Bos indicus）起源的。此外，以秦川牛为参照，在南阳牛基因组中共检测到2,907个CNV，占整个基因组的0.37%，其中，拷贝数减少（loss）的数量远远大于拷贝数的增加（gain），且CNV在X染色体上的分布最多，25号染色体分布最少。在783个CNV区域中发现了495个功能基因，多数都与环境应激、对疾病的免疫应答等过程有关。2.拷贝数变异验证及肌肉生长发育相关候选基因筛选采用荧光定量PCR方法对检测到的CNV进行验证，随机选择了4组（Gain-GENIC,Gain-NON-GENIC, Loss-GENIC和Loss-NON-GENIC）、共20个位点进行检测。结果显示，只有Loss-GENIC组中的Chr7CNV161（SSBP2）和Chr13CNV1410（SNTA1）两个CNV位点与测序结果不一致，其余位点均与测序结果一致，准确率可以达到90%（18/20）。另外，在南阳牛和秦川牛群体中分别选取10个个体对上述位点进一步验证，发现在拷贝数增加组，南阳牛基因组CNV区域的平均拷贝量均大于秦川牛；在拷贝数减少组，南阳牛基因组CNV区域的平均拷贝量均小于秦川牛，与测序结果一致。通过GO和Pathway分析，初步确定了6个与肌肉生长发育相关的候选基因，其中，FHL1、MICAL-L2和MYH3三个基因在牛肌肉组织中高表达，因此，可以作为候选的肌肉发育相关拷贝数变异基因。3.肌肉发育相关CNV基因剂量效应分析将候选的CNV基因与牛CattleQTLdb数据库进行比较，发现3个候选基因（FHL1、MICAL-L2和MYH3）均与牛的一些重要数量性状位点相关，如肌内脂肪含量、尻角度、体高和脂肪酸含量等，预示其可能在相关的表型形成中发挥着重要的作用。3个候选基因的CNV分布在不同的黄牛品种间存在差异，尤其是MYH3基因，在南阳牛群体内的分布最为离散，说明拷贝数目差异较大。剂量效应分析表明，FHL1和MYH3基因的拷贝数增加可以促进其mRNA的表达，且能够显著影响南阳牛的生长性状；MICAL-L2基因的拷贝数增加可以抑制其mRNA的表达，并且与南阳牛的生长性状存在显著的关联。4.牛Pax7基因启动子区变异位点的群体遗传学分析本研究首次在牛Pax7基因启动子区发现一处10-bp（TCGTCTCCCC）拷贝变异位点，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，在黄牛群体内检测到2种拷贝类型，分别为2个拷贝和3个拷贝。统计结果显示，10-bp变异位点不同基因型在5个黄牛群体内的分布差异显著，并且该位点与南阳牛生长性状显著相关，因此，可以作为新的分子标记用于黄牛的育种。5.牛Pax7基因启动子区变异位点的作用机制及剂量效应分析采用双荧光素酶报告系统检测10-bp变异位点不同拷贝数对启动子活性的影响，构建了分别含3个拷贝（pGL3-pro2-3copies）、2个拷贝（pGL3-pro2-2copies）、1个拷贝（pGL3-pro2-1copy）和不含10-bp序列（pGL3-pro2-Δ10-bp）的重组载体，结果显示，3个拷贝的启动子活性最低，2个拷贝或1个拷贝序列活性较高。通过过表达ZNF219基因，表明10-bp序列拷贝数的变化可能会改变转录因子ZNF219的结合位点，进而影响Pax7基因的启动子活性。此外，该变异位点能够影响Pax7基因及其下游基因（Id2、Id3和CXCR4）的mRNA表达水平，并且2个拷贝纯合个体的基因表达水平显著高于3个拷贝。由此可见，功能基因启动子区的短片段拷贝变异能够通过剂量效应影响启动子活性，进而改变基因的表达量及个体的表型性状。