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蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2, PAR-2)属于G蛋白偶联受体,研究显示PAR-2广泛存在于动物的胃肠道组织中,具有介导和抵抗炎症的作用,对胃肠道疾病有重要的调节作用。断奶仔猪腹泻(Diarrhea of weaning piglets,PWD)是仔猪在断奶期间由多种因素引起的腹泻病的总称,仔猪断奶腹泻有发病率高、致死率高的特点,严重危害养猪业的发展。本试验把PAR-2和断奶仔猪腹泻病联系起来,为了阐明PAR-2与断奶仔猪胃肠道粘膜屏障的关系,从而了解PAR-2在仔猪腹泻病理过程中的作用,为防治“仔猪早期断奶综合征”提供一定的依据。本实验从以下列两个方面进行了分析研究。1.PAR-2与胃肠粘膜系统在断奶仔猪腹泻过程中相关性研究以体重为(10±0.3)kg,25-28日龄的30头早期断奶仔猪为研究对象,对其中的18头断奶仔猪每头口服接种1.0×1011cfu/ml的ETEC大肠杆菌5ml而建立腹泻模型。选取其中腹泻比较明显的12头仔猪作为腹泻组,12头健康仔猪作为正常组。在仔猪腹泻的第1d、3d、5d和第7d屠宰仔猪,采集样品。取腹泻组与正常组仔猪的胃肠道组织,利用HE染色观察胃肠道组织的病理学变化；采用免疫组化、Western Blotting及荧光定量PCR技术观察PAR-2、Claudin-1、Occludin及ZO-1mRNA和蛋白水平上的变化；利用ELISA技术检测血浆中CGRP、IL-6和TNF-α的含量变化,利用生化试验检测组织匀浆中磷脂、氨基己糖和血浆中内毒素、DAO的含量变化。结果显示腹泻仔猪病理组织学变化主要表现为胃肠道粘膜上皮细胞脱落坏死,肠道粘膜层及平滑肌变薄,损伤严重的粘膜固有层内有嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞浸润,肠绒毛凌乱等。PAR-2在整个胃肠道中都有表达,腹泻第3d的PAR-2蛋白与正常组相比表达量增加(P<0.05),强阳性反应主要存在于粘膜固有层的上皮细胞的顶端,血管上皮细胞,腺细胞的基底部,嗜酸性粒细胞及中性粒细胞等,所有的对照组均无阳性反应。PAR-2 mRNA在腹泻的第1d、3d、5d和第7d都有明显的增加,且在回肠和结肠中更明显。随着腹泻时间的延长,Claudin-1、Occludin及ZO-1在蛋白和基因水平上都有明显的变化,三种蛋白在回肠和结肠变化差异显著,提示随着腹泻时间的延长,胃肠粘膜的损伤越严重,但肠道更为显著。在仔猪腹泻的第3d胃黏膜组织中氨基己糖与正常组相比含量降低(P<0.05),而第1d、第5d及第7d不显著,且均低于正常组。磷脂在腹泻的第3d和第5d比正常组低(P<0.05),而第1d和第7d差异不显著,且均低于正常组。腹泻组仔猪随着腹泻时间的延长,血浆中内毒素、TNF-α、IL-6及DAO的含量都显著或极显著升高。在仔猪腹泻的第3-7d,上述各指标与正常对照组相比含量都明显增加(P<0.01),而在腹泻的第1d,内毒素、DAO虽然高于对照组(P>0.05)。CGRP与对照组相比,第1d和第5d差异不显著,第3d和第7d血浆中的含量明显降低(P<0.05),且均明显降低。这部分实验结果提示PAR-2与仔猪胃肠道粘膜系统呈负相关。2.PAR-2对猪小肠上皮细胞IL-6、IL-8的分泌以及TJ连接蛋白的影响研究取新生仔猪小肠组织,采用酶消化法培养原代小肠上皮细胞,再进过纯化传代培养形成单层细胞,在细胞中添加胰蛋白酶、大豆蛋白酶抑制剂、人工合成PAR-2激动剂SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2、LPS及LT刺激剂,在刺激时间分别为2h、14h和24h时,利用ELISA法检测猪小肠上皮细胞细胞上清液中IL-6、IL-8的含量,利用荧光定量PCR技术检测PAR-2、Claudiri-1、Occludin及ZO-1 mRNA水平的变化。结果显示,对照组中小肠上皮细胞释放IL-6和IL-8的量很低几乎可以忽略不计,但是在PAR-2激动剂(胰蛋白酶和SLIGRL-NH2)刺激猪小肠上皮细胞释放IL-6和IL-8,并且在LPS及LT存在的情况下释放量更显著。在刺激24h后,PAR-2激动剂组IL-6和IL-8的含量与正常组相比明显升高(P<0.05),且有LPS+LT存在时IL-8的含量更高于正常组(P<0.01)。Claudin-1、Occludin及ZO-1 mRNA在PAR-2激动剂刺激作用24h后,表达量明显低于空白对照、反激动肽、大豆蛋白酶抑制剂组,(P<0.05)其中Claudin-1变化最为明显。以上的结果提示,PAR-2对胃肠道粘膜屏障有负调控作用,在断奶仔猪腹泻病理过程中有一定介导作用。激活后的PAR-2可以促进炎性细胞因子的产生,炎性因子的高表达又可以使中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞迁移,从而调解胃肠道炎症反应。而且炎性细胞因子浓度的变化可以使Claudin-1、Occludin及ZO-1三种TJ连接蛋白表达量降低,移位等,导致而TJ结构受损,破坏上皮细胞的屏障作用。