自1998年秋冬始于河北省石家庄地区的低致病性禽流感(LPAI)爆发,传播速度很快,短期内即成燎原之势,在近一年的时间里已波及到包括我国主要养禽地区的20多个省、市、自治区。经鉴定各地分离的毒株主要为H9N2亚型。这次全国范围的大流行,已历经数年,至今尚未平息。发病种鸡群和蛋鸡群损失严重,产蛋率下降10-60%不等,个别鸡群甚至绝产；育雏鸡、育成鸡及肉鸡也可感染发病,表现呼吸道症状,受害鸡群死淘率急剧上升,根据鸡群并发和继发感染及饲养管理状况的不同,死淘率在10-80%之间,一般在20%左右。近年来我国部分地区的禽流感血清学调查发现,H9亚型阳性群占禽流感阳性鸡群总数的93.89%,进一步说明这种禽流感的广泛性和严重危害性。基于上述情况,我国迫切需要针对H9亚型的禽流感疫苗,用于控制日益严重的H9亚型禽流感在我国的大范围流行。目前我国新城疫发病流行也非常严重,有时与H9亚型的禽流感病毒混感,给养鸡业造成更大损失。同时基层养鸡户防疫频繁,应激反应大,免疫程序难以制定,急需一针防两病的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗。我们在成功研究出禽流感(H9亚型)灭活疫苗基础上,又研制出鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗。一、禽流感(H9亚型)灭活疫苗毒种的筛选培育和鉴定在1998-1999年期间,我国主要养禽地区5个省、市鸡群分离鉴定出8株H9N2亚型禽流感病毒(AIV),进行了系统的常规生物学和分子生物学特性鉴定,从中筛选、培育出对鸡胚的毒力稳定、产生的毒价高、免疫原性强、交叉保护性好的F株(A/Chicken/Shanghai/F/98)作为研制疫苗的候选毒株F株基因组全长序列测定和各基因的遗传分析表明,其HA、NA、M和NS4个基因均属于CkBj94分支,同源率分别为96.7%、96.4%、97.5%和98%。1、在1998-1999年期间从我国主要养禽地区5个省、市有产蛋下降的产蛋鸡群和有呼吸症状及超常死亡的鸡群分离8株AIV(F、S、A1、H1、D1、D2、J1、J2),初次分离时鸡胚死亡时间36-60小时,HA滴度22-24不等,血清亚型鉴定均为H9N2亚型,4周龄SPF雏鸡致病性试验确定均为低致病性。2、测定了这8个毒株的主要保护性抗原HA基因的全长序列,由其推导的氨基酸序列同源性在95%以上,在HA基因遗传发生树上这些毒株与CkBJ94一道形成一个独特的分支,提示有共同来源；8株病毒的交叉HI试验、交叉鸡胚中和试验和雏鸡交叉保护试验均表明,它们之间能提供交叉保护。3、在8株病毒中,选择初次分离时毒价高、鸡胚死亡时间一致的F株在SPF鸡胚中连续继代培育,第5代(E5)时鸡胚液病毒滴度达HA210,至第10代(E10)时HA滴度大于210。经系统鉴定,它对鸡胚的毒力稳定,(90%以上鸡胚在接种后72-96小时内死亡),产生病毒的滴度高(HA大于210),免疫原性强(7日龄SPF鸡免疫后HI滴度>5log2),交叉保护性好,具有优良的疫苗毒株特性。4、通过RT-PCR和51/31RACE法扩增、各片段克隆测序和序列拼接,得到了F株的基因组全长序列,8个基因长度分别为PB12341bp、PB22341bp、PA2233bp、HA1742bp、NP1565bp、NA1458bp、M1027bp、NS8906bp,并对各基因进行遗传分析,其HA、NA、M、NS4个基因均属于CkBJ94分支,同源率分别为96.7%、96.4%、CkBj94株。二、鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的研制和生产用新城疫LASOTA株和H9N2亚型AIV F株为毒种,经实验室研究、田间试验、中间试制和区域试研制出对不同品种和年龄的鸡安全而免疫效力高的新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗,可以达到与各自单苗具有相同免疫效果。已取得了国家新兽药证书和农业部颁发的生产批准文号,累计生产应用2亿羽份以上,产生了巨大的经济效益和社会效益。1、使用Millipore超滤浓缩机的4#膜浓缩新城疫和禽流感抗原,各浓缩1/2-1/3,测定HA效价,NDHA>1024,AIHA>512,按1：1比例配苗。2、二联苗效力试验表明,三批疫苗每羽份新城疫分别含有127、131和127PD50,达到英国兽药典每羽份≥50PD50的要求。禽流感的免疫抗体水平及攻毒保护均达到单苗的要求。免疫鸡日龄太小(小于10日龄),鸡体免疫应答反应较差,效力检验最好采用3-4周龄易感鸡。3、抗体产生时间试验表明,无论免疫剂量多大,疫苗免疫后前4天都测不出抗体,免疫后7天,抗体开始缓慢上升,11天后,抗体上升加快,至21天基本达到高峰。免疫剂量大的,抗体继续上升；免疫剂量小的,抗体滴度就不再上升。相同剂量免疫时,免疫鸡日龄越小,抗体上升越慢,上升幅度越小。攻毒试验表明,免疫后11天攻毒,只有部分免疫鸡被保护,14天攻毒时,大部分免疫鸡保护,21天后方能完全保护。免疫剂量与免疫期试验表明,在一定免疫剂量范围内,免疫保护期与免疫剂量成正相关。免疫剂量偏低时,免疫保护期短；免疫剂量大时,免疫保护期适当延长。二联苗的免疫剂量和免疫期分别定为：商品肉鸡5日龄免疫,0.2m1/羽,出栏前免疫一次；蛋雏鸡和种雏鸡开产前免疫2次,14日龄首免,0.2m1/羽,可保护至60日龄,50-60日龄二免,0.5m1/羽,可保护至开产；或于21-30日龄免疫一次,0.5m1/羽,也可保护至开产。产蛋鸡开产前免疫一次,0.5m1/羽,可保护整个产蛋期。4、中间试制：在易邦公司生物制品GMP车间共试制10批次总量为540万羽份,成品检验全部合格。5、区域试验在江苏、山东、天津、河北等省、市的数十个养禽企业进行区域试验,共免疫800余万羽,临床保护率接近100%,取得很满意的效果。三、H9亚型禽流感发病机理研究：与大肠杆菌联合感染的致病协同作用用H9N2亚型AIV和禽源性大肠杆菌进行联合感染实验研究,结果发现两者之间有强烈的致病协同作用：AIV(H9N2亚型)单独感染症状轻微,不死亡或死亡率很低,但是与禽源性大肠杆菌,甚至是低致病性的大肠杆菌联合感染均可发生严重死亡,病变出现早、恢复慢且更为严重。1、H9N2亚型AIV和禽源性大肠杆菌联合感染时能产生致病协同作用：AIV单独感染(105.17ELD)时死亡率为6.25%,大肠杆菌(037)单独感染(3x107CFU)时死亡率为62.5%,联合感染时死亡率为81.25%。这种致病协同作用在低致病性的禽源大肠杆菌和AIV之间更为显著,单独感染和联合感染的死亡率分别为20.0%、13.3%和100%。2、H9N2亚型AIV和禽源大肠杆菌联合感染SPF鸡的动态病理变化：单独接种的两组接种后1-96小时内无死亡,联合感染组死亡率为24%：联合感染组死亡率为24%；联合感染组大体病变和显微病变比单独接种的两组出现得早、恢复慢且更为严重。