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刺槐(Robinia pseudoacacia L.)是我国重要的多用途经济树种,在木材、抗逆性、生物量等方面都具备十分优良的特性。寒冷是限制刺槐发展的一个重要因子(Hart K H等,2000)。在我国的黄土丘陵地带,刺槐是重要的造林先锋树种,但是在晚霜和严寒危害下,常存在着干、冠分杈,枯梢等现象,严重影响着刺槐的生长。利用基因导入技术可以在短时期内达到育种的目标,本试验旨在将抗寒转录因子导入速生用材型刺槐,希望得到抗寒性较强的刺槐新品种,促进速生用材型刺槐在北方地区的大规模推广。 建立高效再生体系是进行遗传转化的基础。本试验以MS为基本培养基,以刺槐的复叶为外植体,筛选出刺槐复叶离体培养的最佳生长调节剂为NAA、BA。通过对刺槐复叶中小叶和叶轴两部分的再生试验,确定刺槐的叶轴作为本试验进行遗传转化的受体材料。再生培养基配方为MS+BA2.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L,叶轴的再生率可达到80%以上。 并与此同时进行复叶通过愈伤组织诱导阶段分化不定芽的试验,结果表明复叶在MS+BA1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L培养基上产生的愈伤组织可以在MS+BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L中分化不定芽,再生的植株生长健壮,表现良好。给予不同外植体(叶片、叶柄、茎段)的再生最适条件,进行不定芽的分化试验,结果表明叶轴分化的不定芽在质和量上均最优。 以刺槐叶轴为材料,进行卡那霉素和头孢霉素的敏感性试验,确定卡那霉素进行抗性芽的初选浓度为30mg/L,继代筛选提高到50mg/L;头孢霉素抑菌浓度为200mg/L。并对转化体系进行优化,确定继代20~35d的刺槐无菌苗的叶轴最适合作为遗传转化的受体材料;延迟筛选的时间为7~9d;培养方式采用前期暗培养法,在有抗性芽产生后立刻转入光照培养,以利于抗性芽的生长。通过根癌农杆菌的介导将抗寒转录因子OsDREBL导入刺槐体内,对得到的抗性植株进行PCR检测,获得2个转基因株系。